一种人原发性骨髓纤维化细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人原发性骨髓纤维化细胞株及其构建方法和应用。原发性骨髓纤维化细胞株命名为人原发性骨髓纤维化细胞株ZYXY

【技术实现步骤摘要】
一种人原发性骨髓纤维化细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种人骨髓纤维化细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]血液系统源于髓系的恶性肿瘤依据发病时原始细胞分化水平、比例及细胞形态及分子特点分为急性髓系白血病及其相关肿瘤和慢性髓系肿瘤。慢性髓系肿瘤中最常见是BCR
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ABL融合基因阳性的慢性髓系白血病和BCR
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ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤(MPN)。MPN中最为常见的是真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)三种疾病。研究表明JAK2、CALR、MPL突变在PV、ET、PMF检测阳性的概率为：PV患者中分别为95％、0％、0％,ET患者中分别为60％、20％、3％,PMF患者中分别为60％、25％和7％。尽管在基因水平上三种疾病存在很多的相同，但是三种疾病在骨髓的病理、临床表现、疾病进展速度、临床转归及预后上具有明显的不同。
[0003]原发性骨髓纤维化(PMF)是MPN中以干细胞衍生的克隆性骨髓增殖为特征，通常但不总是伴有JAK2、CALR或MPL突变，约10％
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15％的呈现JAK2、CALR或MPL突变阴性。临床特征包括骨髓网状蛋白/胶原纤维化、异常的炎性细胞因子表达、贫血、肝脾肿大、髓外造血(EMH)、全身症状(如疲劳、夜间出汗、发热)、恶病质、白血病进展和生存期缩短。相较于PV和ET，PMF的预后最差。研究表明三种疾病的总体中位生存时间PV是20年，ET是14年，PMF仅有6年。对于PMF目前为止国际上共先后提出5种预后分层体系，对于高危的PMF其中位生存时间不足2年。死亡原因包括大约20％的患者发生白血病进展，许多患者也死于合并症，包括心血管事件和血细胞减少症的后果，包括感染或出血。
[0004]当前PMF治疗手段极其有限，异基因造血干细胞移植(AHSCT)是当前唯一可以延长患者生存时间或使患者治愈的方法，但是接受AHSCT的患者至少存在50％的移植相关严重并发症或移植相关死亡。因此，对于个体患者，必须权衡AHSCT的风险与未进行AHSCT的预期生存率。研究表明，PMF患者匹配相关移植的5年无病生存率(DFS)和治疗相关死亡率(TRM)分别为33％和35％，无关移植分别为27％和50％，复发率高达29％。PMF传统药物治疗包括羟基脲和鲁索替尼，但是仅限于改善患者的临床症状，没有抗肿瘤活性，也没有已被证明可以逆转骨髓纤维化或诱导细胞遗传学或分子缓解。PMF患者对羟基脲和鲁索替尼有反映的仅在15％～25％,反应时间也仅持续1年左右。近年来新的JAK抑制剂，如费拉替尼、莫莫替尼和帕克替尼目前正在进行临床实验，也仅作为鲁索替尼耐药的替代治疗。由此可知当前PMF的药物治疗仅作为姑息性的治疗手段。JAK2突变在PMF中占65％左右，也有待进一步发掘JAK2阴性患者的治疗药物。
[0005]PMF的预后及转归与其分子特点密切相关。研究表明JAK2、CALR或MPL突变可能介导了PMF的骨髓纤维化，但是其向白血病的转化可能与其他基因突变相关，如TET2、ASXL1、IDH1/2、EZH2、DNMT3A、CBL、RAS、IKZF1、TP53、SF3B1、SRSF2、U2AF1基因均在PMF发现。ASXL1、SRSF2、EZH2、IDH1、IDH2、U2AF1Q157被纳入PMF的危险分层体系中。
[0006]综上所述，当前PMF是MPN中高转白血病率、预后最差，治疗手段有限。肿瘤的研究基础性工具是肿瘤细胞株，因为细胞株具有体外无限增殖能力和良好的体内成瘤能力，克服了原代细胞有限的局限性。肿瘤细胞也是进行抗肿瘤药物筛选和肿瘤治疗方案验证的有效工具。目前国内外均未建立起由PMF病人起源的细胞株。国外已建立起源于CML的细胞株K562和源于ET的细胞株SET
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2，对这两种疾病的基础及临床研究具有巨大的推动作用。因此亟待建立起源于PMF的细胞株，以用于预后最差的PMF的发病机理，分子特点，新药筛选，化疗方案更新等的研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一株人原发性骨髓纤维化永生化细胞株及其构建方法及应用。
[0008]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种人原发性骨髓纤维化细胞株，该细胞株命名为人骨髓纤维化细胞ZYXY
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M2，于2021年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202145。
[0009]本专利技术提供的人原发性骨髓纤维化细胞JAK2突变阴性、CALR突变阴性、MPL突变阴性，ASXL1突变阳性,TP53突变阳性,FLT3突变阳性，IKZF1突变阳性。细胞形态呈原始红细胞，细胞表面不表达CD34、CD11b、表达CD71。细胞株细胞呈悬浮生长或弱贴壁生长。
[0010]本专利技术还提供如上所述人原发性骨髓纤维化细胞株的用途，选自以下任一项或多项：
[0011]a.用于骨髓纤维化的分子特点及治病机理的研究；
[0012]b.制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；其中，肿瘤细胞模型包括通过本细胞株建立起来的子代细胞或在本细胞株建立起来的子代细胞通过转染带荧光标记的基因建立起来的细胞。动物肿瘤模型包括通过皮下荷瘤或尾静脉注射建模的方法，建立的PMF的动物模型。
[0013]c.筛选和/或评价肿瘤治疗药物；其中，筛选肿瘤治疗药物的方法可以为：通过向所述人原发性骨髓纤维化细胞株培养基中添加不同肿瘤治疗药物，观察细胞形态变化，获得初步有效的候选药物。然后，将候选药物施药于所述细胞，计算筛选出来的有效药物的半数抑制浓度(I50)，选择IC50最低的药物进一步作用于动物模型，与未施药组动物的存活期、肿瘤大小、转移情况等进行比较，筛选获得潜在的治疗PMF的药物。
[0014]d.开发肿瘤药物靶点；
[0015]e.制备肿瘤诊断产品，如特异性标志的流式抗体，基因检测试剂盒等；
[0016]f.筛选肿瘤生物治疗药物/试剂；所述的肿瘤生物治疗药物/试剂为肿瘤疫苗。
[0017]g.开发检测肿瘤相关生物工程产品。所述的肿瘤相关生物工程产品可以为PMF特异性的分子诊断PCR试剂盒，荧光原位杂交试剂盒等。
[0018]本专利技术还提供所述人原发性骨髓纤维化细胞株的构建方法，具体如下：
[0019]获得新鲜的初发诊断明确的原发性骨髓纤维化(PMF)患者外周血。取6ml外周血滴加入预先加6ml淋巴细胞分离液的15ml无菌离心管中，离心2000转，20分钟。离心结束后取单个核细胞层白色细胞沉淀至新的15ml无菌离心管中，加入5ml无菌1xPBS重悬细胞，离心2000转，5分钟。弃上清液后，加入无菌的红细胞裂解液常温下裂解细胞5分钟后离心，2000
转，5分钟。弃上清，加入5mlIMDM完全培养基(IMDM 90％+胎牛血清10％)重悬细胞，离心，1500转，5分钟。弃上清，加入5mlIMDM完全培养基，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人原发性骨髓纤维化细胞株，其特征是，该细胞株命名为人骨髓纤维化细胞ZYXY
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M2，于2021年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：202145。2.根据权利要求1所述的人原发性骨髓纤维化细胞株，其特征是，细胞形态呈原始红细胞，细胞表面不表达CD34、CD11b、表达CD71。细胞株细胞呈悬浮生长或弱贴壁生长。3.根据权利要求1所述的人原发性骨髓纤维化细胞株，其特征是，细胞呈JAK2突变阴性,CALR突变阴性,MPL突变阴性,ASXL1突变阳性,TP53突变阳性,IKZF1突变阳性,IDH1突变阳性TET1突变阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：金洁，李枫林，周一乐，俞文娟，王敬瀚，黄昕，王云贵，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：