编码Trk片段的核酸构建体及其利用制造技术

本发明专利技术提供一种编码Trk家族的功能性片段的新型核酸构建体及其利用。本发明专利技术的一实施方式的核酸构建体编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。序列的融合多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】of the WAVE complex.Proc Natl Acad Sci USA 107(16):7586
‑
7591,2010.
[0016]非专利文献7：Namekata K,Harada C,Guo X,Kimura A,Kittaka D,Watanabe H,Harada T.Dock3 stimulates axonal outgrowth via GSK
‑
3β
‑
mediated microtubule assembly.J Neurosci 32(1):264
‑
274,2012.
[0017]非专利文献8：Namekata K,Kimura A,Kawamura K,Harada C,Harada T.Dock GEFs and their therapeutic potential:neuroprotection and axon regeneration.Prog Retin Eye Res 43:1
‑
16,2014.
[0018]非专利文献9：行方和彦、原田高幸，神经轴突的再生中的Dock3的功能，生物化学84(5),368
‑
373,2012.

技术实现思路

[0019]专利技术所要解决的技术问题
[0020]如上所述，已经开始从各种观点阐明TrkB在神经保护等中起到的重要作用。
[0021]然而，在插入有TrkB全长基因的基因载体中，难以诱导TrkB的高表达。这是因为TrkB全长基因具有相对较大的尺寸，因此可使用的启动子尺寸等受到限制。
[0022]并且，在治疗神经相关疾病时，认为不仅需要过量表达TrkB，同时需要定期施用BDNF，因此，至今为止有效利用TrkB的基因治疗研究尚未实用化。
[0023]最近，报道了插入有编码BDNF与TrkB的融合蛋白的基因的表达载体(专利文献1)。然而，从该融合蛋白质的分子尺寸可推测出表达水平并没有那么高。
[0024]本专利技术是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种编码Trk家族的功能性片段的新型核酸构建体及其利用。
[0025]用于解决问题的技术手段
[0026]为了解决上述问题，本专利技术包括以下所示的方面。
[0027](i)一种核酸构建体，其编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。
[0028](ii)一种细胞激活方法，其包括以下步骤：在细胞内通过膜定位序列使Trk的胞内区定位于细胞膜。
[0029](iii)一种融合多肽，其包含Trk的胞内区及膜定位序列。
[0030]专利技术效果
[0031]根据本专利技术的一个方面，可提供一种编码Trk家族的功能性片段的新型核酸构建体及其利用等。
附图说明
[0032]图1是示出组成型激活TrkB(CA
‑
TrkB)的结构的图。
[0033]图2是示出实施例1中制备的腺相关病毒载体的图。
[0034]图3是示出实施例1的结果(CA
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TrkB的表达量)的图。
[0035]图4是示出实施例1的其他结果(利用CA
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TrkB的细胞内信号传导)的图。
[0036]图5是示出实施例2的结果(CA
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TrkB对视网膜神经节细胞的保护)的图。
[0037]图6是示出实施例2的结果(利用CA
‑
TrkB的视神经轴突再生)的图。
[0038]图7是示出实施例3的结果(使用青光眼模型小鼠的CA
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TrkB对视网膜神经节细胞
的保护)的图。
[0039]图8是示出实施例4的结果(使用CA
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TrkB的变体的信号传导的验证)的图。
[0040]图9是示出实施例5相关的组成型激活TrkA及TrkC的结构、及实施例5的结果(利用CA
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TrkA及CA
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TrkC的细胞内信号传导)的图。
[0041]图10是示出编码实施例中的iSH
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TrkB的基因片段的碱基序列的图。
[0042]图11是示出编码实施例中的CA
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TrkA的基因片段的碱基序列的图。
[0043]图12是示出编码实施例中的CA
‑
TrkC的基因片段的碱基序列的图。
[0044]图13是示出实施例6的结果(视觉诱发电位的测量)的图。
具体实施方式
[0045][术语等的定义][0046]在本说明书中，“多核苷酸”也可以称为“核酸”或“核酸分子”。若无特别说明，“多核苷酸”包括含有能够与天然存在的核苷酸同样地发挥功能的天然存在的核苷酸的已知类似物的多核苷酸。另外，“碱基序列”也可以称为“核酸序列”或“核苷酸序列”。只要未特别提及，“碱基序列”是指脱氧核糖核苷酸的序列或核糖核苷酸的序列。并且，多核苷酸可以是单链或双链结构，若为单链，则可以是正义链或反义链。
[0047]在本说明书中，“基因”是指编码蛋白质的“多核苷酸”。
[0048]在本说明书中，基因的“表达控制区”是指控制基因的表达的“多核苷酸”。作为“表达控制区”的一个例子，可列举启动子区、增强子区等。
[0049]在本说明书中，“表达盒”是指包括在表达宿主内发挥功能的表达控制区、以及与该表达控制区可操作地连接的多核苷酸的表达单位。在表达盒中，该多核苷酸优选为基因或基因片段。作为一个例子，表达盒是在基因工程学上将上述表达控制区与上述多核苷酸连结而成。“可操作地连接”是指多核苷酸的表达受控于表达控制序列的状态。表达盒也可以是表达载体的形态。
[0050]在本说明书中，“多肽”也可以称为“蛋白质”。“多肽”包含氨基酸通过肽键结合而成的结构，还可以包含例如糖链或类异戊二烯基等结构。若无特别说明，“多肽”包括含有能够与天然存在的氨基酸同样地发挥功能的天然存在的氨基酸的已知类似物的多肽。
[0051][1.核酸构建体][0052]本专利技术的一实施方式的核酸构建体是编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽的核酸构建体。本专利技术是基于如下惊人发现完成的：通过使该核酸构建体在细胞内表达，即使不施用神经营养因子(Neurotrophin)，也能够激活Trk的下游的细胞内信号传导途径。即，本案专利技术涉及一种细胞激活的新方法，通过由该核酸构建体编码的融合多肽所具有的膜定位序列，使Trk的胞内区定位于细胞膜。
[0053]本实施方式的核酸构建体例如起到以下的代表性效果。
[0054]1)不需要过量表达或施用对应的神经营养因子。
[0055]2)与Trk全长相比，能够大幅减小激活所需要的分子尺寸。由此，能够实现分子的高表达化。此外，核酸构建体的设计自由度大幅增加，因此，例如能够更容易地实现高表达化或基因导入效率的提升等。
[0056](融合多肽)
[0057本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸构建体，其编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，Trk的胞内区选自下述中的任一者：1)由序列编号2、6、9、12或14中的任一者所记载的氨基酸序列表示的多肽；2)由与序列编号2、6、9、12或14中的任一者所记载的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列表示的多肽。3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，膜定位序列诱导氨基酸的脂质修饰。4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中，膜定位序列是法尼基化序列。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体为载体。6.根据权利要求5所述的核酸构建体腺，其中，所述核酸构建体为腺相关病毒载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：行方和彦，原田高幸，
申请(专利权)人：公益财团法人东京都医学综合研究所，
类型：发明
国别省市：