PLA2R重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了PLA2R重组蛋白的制备方法。为了解决全长PLA2R重组蛋白不易制备、产量较低、生产周期长、成本较高、不适合大规模生产等问题，本发明专利技术提供一种用于制备PLA2R重组蛋白的核酸序列，其包括His标签序列、PLA2R全长序列、TEV酶识别序列和Fc基因序列，并结合昆虫表达体系和特定的纯化方法，提高全长PLA2R重组蛋白的产量和纯度，且适合大规模生产，生产周期缩短，成本降低，更适应市场的需求。更适应市场的需求。

【技术实现步骤摘要】
PLA2R重组蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及诊断原料试剂领域，具体涉及一种PLA2R重组蛋白的制备方法。

技术介绍

[0002]膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是成人肾病综合征的常见病理类型之一。在我国，MN在原发性肾小球疾病中的患病率倍增，其中约80％为特发性MN(idiopathic MN,IMN)。此外，儿童肾病综合征中MN患者比例亦呈逐年上升趋势。30％～40％的IMN患者最终可发展为终末期肾脏疾病；M也是肾脏移植后疾病复发的主要原因之一。作为一种自身免疫性疾病,靶抗原对应的抗体在IMN的发病机制应中起关键作用。因此，寻找IMN的靶抗原一直是该领域的研究热点。
[0003]2009年Beck等研究指出，M型磷脂酶A2受体(M
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type phospholipase A2 receptor，PLA2R)为IMN的靶抗原，并表示70％IMN患者为PLA2R相关性IMN。这些开创性的发现使靶抗原的相关检测技术，尤其是PLA2R在临床中对IMN的诊治指导、疾病监测及预后判断等方面迅速地开展。抗原抗体的特异性结合反应仅发生在某个特定的免疫区域，即抗原位，又名抗原决定簇，各种免疫细胞通过结合和识别抗原表位以发挥免疫效应、激发免疫应答，自身抗体与抗原表位结合可诱发自身免疫性疾病。对IMN的主要靶抗原PLA2R的抗原表位进行深入认识，有助于理解IMN的免疫发病机制及病理生理，同时也有助于开发新型IMN的治疗干预措施，如表位特异性治疗。
[0004]PLA2R抗体的免疫学诊断试剂均需要以PLA2R作为抗原来进行检测，PLA2在不同物种、不同器官中均有不同程度的表达，但其在人类足细胞中表达最高，而在其他大多数物种的足细胞中并不表达。因为人PLA2R蛋白在人体内只有胞外区可以与抗体结合，但是其分子量较大，又为膜蛋白(150kDa)，所以很难从血液中分离纯化获得，而且该蛋白的构象对抗体结合有着极其重要的作用，所以天然蛋白的制备微乎其微且成本极其昂贵，无法满足诊断试剂规模化生产的需要。
[0005]专利CN107663235B公开了一种PLA2R重组蛋白及其应用，其根据PLA2R的胞外区包含的8个C
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type lectin结构域，设计不同的截短体，每个截短体包含至少一个C
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type lectin结构域或者至少包含一个C
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type lectin结构域及其C端连接区；每个截短体与PLA2R胞外区的Ricin B
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type lectin结构域和Fibronectin type
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II结构域组成PLA2R重组蛋白，筛选出表达量高于PLA2R全长蛋白，且具有免疫特异性的重组蛋白。专利CN107663235B虽然也获得了全长PLA2R重组蛋白，但产量不高，不适合大规模表达。虽然专利CN107663235B中显示重组蛋白在胞外区蛋白中去掉部分C
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type lectin结构域不会影响PLA2R重组蛋白与患者自身抗体反应的灵敏度和特异性，但实际应用中发现，进行分段化表达的PLA2R重组蛋白与膜性肾病患者血液中的抗PLA2R抗体的亲和力还是不如天然的PLA2R蛋白，检测结果不是够准确。
[0006]因此，需要开发一种能够提高全长PLA2R重组蛋白的产量和纯度，使全长PLA2R重组蛋白能够规模化生产的制备方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够提高全长PLA2R重组蛋白的产量和纯度的制备方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面提供一种用于制备PLA2R重组蛋白的核酸序列，所述的核酸序列包括His标签序列、PLA2R全长序列、TEV酶识别序列和Fc基因序列。
[0010]优选地，所述的核酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
[0011]本专利技术第二方面提供一种用于制备PLA2R重组蛋白的重组质粒，所述的重组质粒含有所述的核酸序列。
[0012]优选地，所述的重组质粒采用昆虫杆状病毒载体。
[0013]本专利技术第三方面提供一种用于制备PLA2R重组蛋白的细胞株，所述的细胞株含所述的重组质粒。
[0014]优选地，所述的细胞株采用昆虫细胞Sf9作为宿主细胞。
[0015]本专利技术第三方面提供一种PLA2R重组蛋白的制备方法，包括制备PLA2R重组蛋白过表达细胞株和PLA2R重组蛋白纯化，采用所述的核酸序列、或所述的重组质粒、或所述的细胞株制备PLA2R重组蛋白过表达细胞。
[0016]优选地，所述的PLA2R重组蛋白过表达方法包括：
[0017](1)将所述的核酸序列转入昆虫杆状病毒载体质粒，构建PLA2R杆状病毒载体；
[0018](2)将所述的PLA2R杆状病毒载体转化至含有Bacmid穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，得到重组Bacmid质粒；
[0019](3)采用PCR鉴定为阳性的所述的重组Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9得到转染细胞株；
[0020](4)培养所述的转染细胞株得到P0代病毒；
[0021](5)使用所述的P0代病毒感染昆虫细胞Sf9得到Pl代病毒；
[0022](6)使用所述的Pl代病毒感染昆虫细胞Sf9，培养感染后昆虫细胞Sf9至细胞出现肿胀，收集细胞，即PLA2R重组蛋白过表达细胞，
[0023]或，(1)采用所述的重组质粒转染昆虫细胞Sf9得到转染细胞株；
[0024](2)培养所述的转染细胞株得到P0代病毒；
[0025](3)使用所述的P0代病毒感染昆虫细胞Sf9得到Pl代病毒；
[0026](4)使用所述的Pl代病毒感染昆虫细胞Sf9，培养感染后昆虫细胞Sf9至细胞出现肿胀，收集细胞，
[0027]或，(1)培养所述的转染细胞株得到P0代病毒；
[0028](2)使用所述的P0代病毒感染昆虫细胞Sf9得到Pl代病毒；
[0029](3)使用所述的Pl代病毒感染昆虫细胞Sf9，培养感染后昆虫细胞Sf9至细胞出现肿胀，收集细胞。
[0030]进一步优选地，所述的PLA2R重组蛋白纯化方法包括：
[0031]S1经所述PLA2R重组蛋白过表达细胞与提取液混合，经超声破碎细胞、离心取上清液，所述上清液经35～42℃水浴、离心，下层为含所述的PLA2R重组蛋白的提取物；
[0032]S2将步骤S1得到的沉淀物采用TEV酶缓冲液重悬，然后在惰性气体的保护下于0～
8℃下转动过夜得到重悬液；
[0033]S3将步骤S2得到的重悬液过镍柱，采用咪唑溶液洗脱，收集洗脱液；
[0034]S4将步骤S3得到的洗脱液进行PBS过夜透析，经微滤得到所述的PLA2R重组蛋白。
[0035]本专利技术第四方面提供一种采用所述的制备方法制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于制备PLA2R重组蛋白的核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列包括His标签序列、PLA2R全长序列、TEV酶识别序列和Fc基因序列。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。3.一种用于制备PLA2R重组蛋白的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒含有权利要求1或2所述的核酸序列。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒采用昆虫杆状病毒载体。5.一种用于制备PLA2R重组蛋白的细胞株，其特征在于，所述的细胞株含权利要求3或4所述的重组质粒。6.根据权利要求5所述的细胞株，其特征在于，所述的细胞株采用昆虫细胞Sf9作为宿主细胞。7.一种PLA2R重组蛋白的制备方法，包括制备PLA2R重组蛋白过表达细胞和PLA2R重组蛋白纯化，其特征在于，采用权利要求1或2所述的核酸序列、或权利要求3或4所述的重组质粒、或权利要求5或6所述的细胞株制备PLA2R重组蛋白过表达细胞。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的PLA2R重组蛋白过表达方法包括：(1)将权利要求1或2所述的核酸序列转入昆虫杆状病毒载体质粒，构建PLA2R杆状病毒载体；(2)将所述的PLA2R杆状病毒载体转化至含有Bacmid穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，得到重组Bacmid质粒；(3)采用PCR鉴定为阳性的所述的重组Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9得到转染细胞株；(4)培养所述的转染细胞株得到P0代病毒；(5)使用所述的P0代病毒感染昆虫细胞Sf9得...

【专利技术属性】
技术研发人员：许旭旭，葛宵鹏，张睿，徐长银，
申请(专利权)人：迪亚莱博张家港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：