一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体公开了一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途，通过sgRNA模板的合成和体外转录，每粒卵显微注射sgRNA/Cas9蛋白，显微注射后G0代突变检测突变的发生情况。本发明专利技术的方法成功发现了2个可用于敲除Period基因的靶标位点，对于Period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。奠定了基础。奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途。

技术介绍

[0002]Period为作为人们发现并鉴定的第一个昆虫生物钟基因，研究发现它调节着昆虫的而各种生理行为，如Per基因的表达紊乱会扰乱蟋蟀的昼夜节律
[140]，影响苹果小卷蛾生殖系统精子的节律释放
[141]，会打乱家蚕的羽化和孵化行为
[142]以及影响着哺乳动物身体的饮食健康
[143]等。此外Per还与其他生物钟基因，联合执行功能，它们之间在功能可能还存在补偿关系。因而就需要全方位的研究生物钟基因在体能执行的功能，这样才能更好地为服务于人类和自然作出贡献。根据上述研究结果表明斜纹夜蛾两性交流活动存在明显的昼夜节律性特征，而部分生物钟基因的节律表达也反映出较为相似的特征，其中以生物钟基因Period的节律性最为相似，为进一步分析生物钟基因对斜纹夜蛾两性交流活动可能存在的调控机理。
[0003]斜纹夜蛾在长期危害农作物的过程中常表现出明显的昼夜节律，但目前关于这些节律活动的分子机制尚不明确。因此，深入了解斜纹夜蛾生物钟基因Per在斜纹夜蛾两性交流活动中作用，就必须首先通过基因编辑技术获取可以诱导Per基因突变的靶标点。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途，本专利技术成功发现了2个可用于敲除Period基因的靶标位点，对于Period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。
[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法，具体包括如下步骤：
[0006]S1，sgRNA模板的合成和体外转录：
[0007]第一轮PCR：以CRISPR
‑
Per1
‑
F、CRISPR
‑
Per2
‑
F和CRISPR
‑
R为引物，进行扩增，获得单一条带的产物，备用；
[0008]引物CRISPR
‑
Per1
‑
F，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]引物CRISPR
‑
Per2
‑
F，基因序列如SEQ ID NO.2所示；
[0010]引物CRISPR
‑
R，基因序列如SEQ ID NO.3所示；
[0011]第二轮PCR：以第一轮PCR得到的产物为模板，以引物sgRNA
‑
F和sgRNA
‑
R为引物进行扩增，纯化后进行体外转录sgRNA；
[0012]引物sgRNA
‑
R，基因序列如SEQ ID NO.4所示；
[0013]引物sgRNA
‑
F，基因序列如SEQ ID NO.5所示；
[0014]S2，显微注射和突变检测：
[0015]收集斜纹夜蛾卵，将S1中得到的sgRNA与Cas9蛋白混合后，记为sgRNA/Cas9，显微注射到斜纹夜蛾卵中，24小时后，提取总DNA，然后以提取的DNA为模板，利用引物Per
‑
jc
‑
F和Per
‑
jc
‑
R进行PCR扩增，检测突变位点；
[0016]引物Per
‑
jc
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0017]引物Per
‑
jc
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0018]进一步地，S1中，第一轮PCR体系为2 x Phanta Max 25μL，引物CRISPR
‑
Per1
‑
F或CRISPR
‑
Per2
‑
F以及CRISPR
‑
R分别1μL，用双蒸水补足50μL。
[0019]进一步地，S1中，第一轮PCR程序如下：98℃预变性15秒，60℃15秒，72℃40秒，30个循环，72℃延伸5分钟。
[0020]进一步地，S1中，第二轮PCR体系为：2x Phanta Max 25μL，第一轮PCR产物1μL，引物sgRNA
‑
F和sgRNA
‑
R各1μL，双蒸水22μL。
[0021]进一步地，S1中，第二轮PCR程序为：98℃预变性12秒，55℃15秒，68℃40秒，35个循环，68℃延伸5分钟。
[0022]进一步地，第二轮PCR结束后获得的产物电泳条带单一，且大小为117bp。
[0023]进一步地，S2中，收集的斜纹夜蛾卵的过程为：收集刚产2小时内纸上的新鲜卵块，以体积分数为5％的甲醛溶液进行卵块消毒。
[0024]进一步地，S2中，每粒卵注射sgRNA/Cas9蛋白1nL，所述sgRNA/Cas9蛋白中sgRNA的浓度为150ng/μL，Cas9蛋白的浓度为3μg/μL。
[0025]进一步地，S2中，PCR扩增过程利用Phanta酶。
[0026]一种所述的Period基因的敲除在调控斜纹夜蛾两性交流活动中的用途。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0028]1、本专利技术利用CRISPR/Cas9技术成功发现了2个可用于敲除Period基因的靶标位点，对于Period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。
[0029]2、本专利技术避免体外基因功能研究的缺陷，能以更为直观可信的数据，为分析基因体内功能提供理论支持。
[0030]3、本专利技术为在分子水平上理解生物钟与斜纹夜蛾两性交流活动的内在机理提供技术支持。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1表示本专利技术实施例1中生物钟基因Per基因结构图以及sgRNA靶标位点的位置信息图；
[0033]其中，方形长框表示外显子，外显子阴影部分表示靶标位点，在靶标位点序列中，3
’
端3个碱基(加粗)为PAM序列，5
’
端ATG为起始密码子，3
’
端TAA为终止子；
[0034]图2表示本专利技术实施例1中合成的sgRNA琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0035]其中，M：DNA分子量标准，F1：Per
‑
F1
‑
sgRNA；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1，sgRNA模板的合成和体外转录：第一轮PCR：以CRISPR
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Per1
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F、CRISPR
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Per2
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F和CRISPR
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R为引物，进行扩增，获得单一条带的产物，备用；引物CRISPR
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Per1
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F，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；引物CRISPR
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Per2
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F，基因序列如SEQ ID NO.2所示；引物CRISPR
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R，基因序列如SEQ ID NO.3所示；第二轮PCR：以第一轮PCR得到的产物为模板，以引物sgRNA
‑
F和sgRNA
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R为引物进行扩增，纯化后进行体外转录sgRNA；引物sgRNA
‑
R，基因序列如SEQ ID NO.4所示；引物sgRNA
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F，基因序列如SEQ ID NO.5所示；S2，显微注射和突变检测：收集斜纹夜蛾卵，将S1中得到的sgRNA与Cas9蛋白混合后，记为sgRNA/Cas9，显微注射到斜纹夜蛾卵中，提取总DNA，然后以提取的DNA为模板，利用引物Per
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jc
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F和Per
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jc
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R进行PCR扩增，检测突变位点；引物Per
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jc
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；引物Per
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jc
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。2.如权利要1所述的一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法，其特征在于，S1中，第一轮PCR体系为2x Phanta Max 25μL，引...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚楠，徐继伟，朱秀云，杨绘绘，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：