基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用技术方案

本发明专利技术创造提供了基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
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Cas13a系统特异性靶向F3
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T3融合基因的crRNA及应用


[0001]本专利技术创造属于生物领域，尤其是涉及基于CRISPR
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Cas13a系统特异性靶向F3
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T3融合基因的crRNA及应用。

技术介绍

[0002]Cas13a是一种RNA引导的CRISPR效应子，能靶向并切割单链RNA (ssRNA)，作为RNA病毒感染性疾病和恶性肿瘤的治疗和诊断工具，引起了极大的关注。CRISPR
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Cas13a系统由两个部分组成，包括靶向RNA的CRISPR
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RNA(crRNA)和由crRNA引导的RNA酶Cas13a。迄今为止，CRISPR
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Cas13a系统被认为是一种在转录水平上直接抑制基因表达的方法。与Cas9相比，Cas13a提供了一种可能更安全的替代方案，因为它会导致功能表型丧失，但不会扰乱基因组。更加重要的是，Cas13a具有独特的“附带切割”效应：在识别其靶RNA后，活化的Cas13a不仅对靶RNA表现出切割作用，而且对非靶RNA也表现出切割作用。
[0003]FGFR3
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TACC3(F3
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T3)融合基因首次在胶质母细胞瘤样本中报道，已成为多种癌症的致癌驱动因子，包括尿路上皮癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、头颈癌、胃肠道癌恶性肿瘤和恶性黑色素瘤。预计大约 1.2
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8.3％的GBM会携带这种染色体易位。编码FGFR3和TACC3的基因位于人类染色体4p16，相距48kb，代表恶性胶质瘤中最常见的FGFR
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TACC染色体重排。FGFR
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TACC融合是有效的癌基因，具有促生长作用并诱导非整倍性。但是，其细胞内信号通路尚不清楚。携带FGFR
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TACC融合的肿瘤患者预后不良，死亡率高。目前，针对 FGFR3
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TACC3融合蛋白仅限于针对FGFRs的激酶抑制剂，这些小分子化合物是典型的多激酶抑制剂，靶向FGFR和其他酪氨酸激酶。因此，精确靶向FGFR3
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TACC3将减少不良反应，对肿瘤的靶向治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于CRISPR
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Cas13a系统特异性靶向F3
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T3融合基因的crRNA及应用。
[0005]为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：
[0006]一种基于CRISPR
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Cas13a系统特异性靶向F3
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T3融合基因的 crRNA，其序列如SEQID NO：1所示。
[0007]一种应用上述crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统。
[0008]一种上述crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统在抑制癌细胞增殖或杀伤肿瘤细胞中的应用。
[0009]优选的，所述crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统通过触发旁效应引起RNA降解来抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞。
[0010]优选的，所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞。
[0011]更优选的，所述胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤细胞。
[0012]优选的，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87细胞或TBD0220细胞。
[0013]一种上述crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统在特异性靶向FGFR3
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TACC3融合基因中的应用。
[0014]优选的，所述Cas13a基因在肿瘤细胞中的表达载体为慢病毒表达载体。
[0015]更优选的，所述慢病毒表达载体为p GV341。
[0016]相对于现有技术，本专利技术创造具有以下优势：
[0017](1)本专利技术创造所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统具有较高的目的基因敲低效率；
[0018](2)本专利技术创造所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统可触发旁效应；
[0019](3)本专利技术创造所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统能够明显抑制胶质瘤细胞增殖；
[0020](4)本专利技术创造所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统能够抑制小鼠颅内肿瘤的形成。
附图说明
[0021]图1为本专利技术创造所述的crRNA1对目的基因的敲低效率图(图1A为四种crRNA在U87
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F3
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T3
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Cas13a细胞中敲低F3
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T3 mRNA的效率，图1B为四种crRNA在TBD0220
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F3
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T3
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Cas13a细胞中敲低 F3
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T3 mRNA的效率)；
[0022]图2为本专利技术创造所述的Cas13a
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crRNA1触发旁效应图(图2A 为从U87和TBD0220细胞群中分离出的总RNA的电泳图，图2B为在 Agilent 2100上测定的RNA完整值；图2C为在Agilent 2100上测定的28S:18S比率)；
[0023]图3为本专利技术创造所述的Cas13a
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crRNA1抑制胶质瘤细胞增殖图 (图3A为在U87和TBD0220细胞中进行的集落形成分析的图像，图3B为图3A中菌落数的量化图，图3C为用CCK8测定U87细胞的生长曲线，图3D为用CCK8测定TBD0220细胞的生长曲线)；
[0024]图4本专利技术创造所述的Cas13a
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crRNA1抑制小鼠颅内肿瘤的形成图(图4A为在植入后第7、14和21天拍摄植入颅内肿瘤的小鼠的代表性生物发光图像；图4B为在植入后第7、14和21天拍摄植入颅内肿瘤的小鼠的生物发光量化信号强度图；图4C为小鼠的生存曲线)。
具体实施方式
[0025]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]下面结合实施例来详细说明本专利技术创造。
[0027]实施例1 crRNA的设计
[0028]遵循叠瓦状的设计原则，设计靶向特异性片段的crRNA文库，共包含4个crRNA：
[0029]crRNA1：
[0030]5’‑
GGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACU本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
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Cas13a系统特异性靶向F3
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T3融合基因的crRNA，其特征在于：所述crRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。2.应用权利要求1所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统。3.权利要求2所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统在抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞中的应用。4.根据权利要求3所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统中的应用，其特征在于：所述crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统通过触发旁效应引起RNA降解来抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞。5.根据权利要求3所述的crRNA介导的CRISPR
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Cas13a基因编辑系统中的应用，其特征在于：肿瘤细胞为胶质瘤细胞。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：康春生，武烨，王琦雪，
申请(专利权)人：天津医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：