一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法技术

本发明专利技术提供了一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，在对血浆样本经过超滤前处理除去大部分血浆高丰度蛋白之后，再采用含有汽巴兰的分离载体，如汽巴兰修饰的氨基磁珠等，将脂蛋白从血浆中分离出来，即可实现血浆脂蛋白和外泌体的分离，该方法分离效果好，简单易行，便于工业化推广应用。上述分离血浆脂蛋白和外泌体的过程，还可以集成于微流控芯片上，从而将相应的操作如分离、检测等模块化，能够提高该过程的自动化程度，实现高效、便捷分离血浆脂蛋白和外泌体的目的，并能够对外泌体和脂蛋白进行分别检测，可推动二者在疾病机制以及诊断中的应用研究。的应用研究。的应用研究。

【技术实现步骤摘要】
一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是涉及一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一种由细胞主动分泌的由膜包裹的大小均一、直径约为30nm
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200nm的脂质双分子层结构小囊泡，脂蛋白是一类由固醇脂、甘油三酯的内核和载脂蛋白、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒，二者均存在于血浆中，可为肿瘤的临床诊断方面提供有价值的遗传信息。
[0003]然而，外泌体的分离和检测一直是一个尚未彻底解决的问题。首先，由于外泌体和脂蛋白密度、尺寸高度重叠，且缺少有效的分离方法，导致研究者获得的血浆外泌体中往往会混入大量脂蛋白，这极大影响外泌体检测方法的灵敏度和准确性；其次，外泌体的异质性非常强，其颗粒直径大小不同，差异甚大，且缺乏特异性的标志物，所以目前对于外泌体的分离和检测方法并无统一标准，暂时无法对提取效果做出客观判断。
[0004]具体的，现有的外泌体的提取方法有：超速离心沉淀、、试剂盒提取法(Exo QuickTM法、qEV技术)等。但这些技术在提取分析液体活检生物样品外泌体时都存在明显的不足。其中，超速离心沉淀法所需初始的资金成本高(超级离心机价格>10万美元)，且后期需要大量的维护和运营成本，同时耗时长、劳动密集，还需要收集较高体积量的样品，所得产品的纯度也较低。试剂盒提取法(ExoQuickTM法、qEV技术)所运用到的试剂盒价格昂贵、所需成本较高，很难在临床和实际操作上实现大规模的运用，且该方法每次提取的外泌体体积仅有1.5mL左右，导致外泌体的浓度较低，如需提取高浓度的外泌体，则要进行进一步的外泌体富集与纯化工作。
[0005]近年来还出现了一种基于尺寸分离的外泌体总分离芯片(exosome total isolation chip,ExoTIC)用于外泌体的提取与分离，该方法是利用压力驱动流体，从而从各种生物流体中高效分离出高纯度的外泌体，但该技术所需的纳米孔薄膜承压能力较弱，易发生纳米孔形变，出现堵孔现象，且该纳米孔薄膜的损伤不可逆，若要落地应用，仍有待继续研究。
[0006]另外，现有的仅针对外泌体分离和提取的方法，也忽略了脂蛋白在疾病研究中的生物学意义。因此，需要开发更高效、更便捷的分离方法来分离血浆外泌体和脂蛋白，实现对外泌体和脂蛋白的分别检测，从而同时推动二者在疾病机制以及诊断中的应用研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术中分离血浆脂蛋白和外泌体方法的不足之处，提出利用汽巴兰对多种脂蛋白优良的亲和性，对血浆中的脂蛋白进行有效分选，实现有效分离血浆脂蛋白和外泌体的目标。
[0008]本专利技术采用的技术方案为：
[0009]一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，包括以下步骤：
[0010]S1：一次分离；对待分离的血浆进行超滤操作，得到中间样品；
[0011]S2：二次分离；将所述中间样品与含有汽巴兰的分离载体混合，将所述脂蛋白从所述中间样品中分离出来。
[0012]在其他优化的技术方案中，所述含有汽巴兰的分离载体为汽巴兰修饰的磁珠。
[0013]在其他优化的技术方案中，所述磁珠包括氨基磁珠、硅基磁珠、羧基磁珠、环氧基磁珠、链霉亲或素磁珠中的至少一种。
[0014]在其他优化的技术方案中，所述磁珠为的粒径为1～3μm。
[0015]在其他优化的技术方案中，所述磁珠上汽巴兰的修饰密度为2～10mmol/L。
[0016]在其他优化的技术方案中，在所述S2步骤中，使用微流控芯片分离所述脂蛋白和外泌体；其中，所述微流控芯片包括通道层和基底层，所述通道层位于所述基底层上；
[0017]所述通道层包括顺次连通的进样区域和混合区域；所述进样区域包括进样口和进样通道，所述中间样品与所述含有汽巴兰的分离载体从所述进样口注入，并通过所述进样通道进入所述混合区域；
[0018]所述混合区域包括若干个混合单元，每个所述混合单元包括至少1个宽通道和至少1个窄通道，所述宽通道的宽度为100～300μm，所述窄通道的宽度为所述宽通道宽度的1/5～1/2。
[0019]在其他优化的技术方案中，所述混合区域包括不少于100个所述混合单元，每个所述混合单元包括1个宽通道和1个窄通道；所述宽通道的长度为200～500μm，所述窄通道的长度不大于所述宽通道的长度；
[0020]其中，所述进样流速为1～10μL/min。
[0021]在其他优化的技术方案中，所述通道层还包括检测区域，所述中间样品与所述含有汽巴兰的分离载体通过所述混合区域进入所述检测区域；所述检测区域包括至少1个腔室，所述腔室的高度不小于0.5mm。
[0022]在其他优化的技术方案中，所述检测区域包括顺次连通的脂蛋白检测腔室和外泌体检测腔室；所述混合区域与所述脂蛋白检测腔室连通，所述脂蛋白检测腔室与所述外泌体检测腔室连通，其中，所述脂蛋白检测腔室的的高度为0.5～1.5mm。
[0023]在其他优化的技术方案中，所述微流控芯片还包括磁铁，所述磁铁设置在所述脂蛋白检测腔室的下方，混合样品流经所述脂蛋白检测腔室时，所述含有汽巴兰的分离载体停留在所述脂蛋白检测腔室，其他部分流入所述外泌体检测腔室，其中，所述外泌体检测腔室的高度为5～10mm。
[0024]本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术经过前处理除去大部分血浆高丰度蛋白之后，再采用含有汽巴兰的分离载体，将脂蛋白从血浆中分离出来，即可实现血浆脂蛋白和外泌体的分离，该方法分离效果好，简单易行，便于工业化推广应用。
[0026]在优化的技术方案中，将上述分离血浆脂蛋白和外泌体的过程进一步集成于微流控芯片上，从而将相应的操作如分离、检测等模块化，能够提高该过程的自动化程度。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图
作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为外泌体样本及血浆样本在汽巴兰修饰的磁珠处理前后的颗粒尺寸分布图，(a)标准外泌体样本在汽巴兰磁珠处理前以及(b)处理后的颗粒尺寸变化；(c)血浆样本在汽巴兰磁珠处理前以及(d)处理后的颗粒尺寸变化；
[0029]图2为汽巴兰磁珠在处理血浆样本后，汽巴兰磁珠上抓取的蛋白样本的蛋白质基峰图，(a)血浆样本中剩余蛋白的蛋白质基峰图(b)以及两者的脂蛋白特征蛋白和外泌体特征蛋白含量比较图(c)；
[0030]图3为实施例5中微流控芯片的通道层示意图；
[0031]图4为普通矩形微通道(a)与实施例5中宽窄相间的混合通道(b)的混合效果模拟图；
[0032]图5为实施例2中对脂蛋白检测腔室和外泌体检测腔室中样本分别进行靶向脂蛋白的量子点染料(Qdot605
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：一次分离；对待分离的血浆进行超滤操作，得到中间样品；S2：二次分离；将所述中间样品与含有汽巴兰的分离载体混合，将所述脂蛋白从所述中间样品中分离出来。2.如权利要求1所述的一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，其特征在于：所述含有汽巴兰的分离载体为汽巴兰修饰的磁珠。3.如权利要求2所述的一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，其特征在于：所述磁珠包括氨基磁珠、羧基磁珠、硅基磁珠、环氧基磁珠、链霉亲或素磁珠中的至少一种。4.如权利要求3所述的一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，其特征在于：所述磁珠为的粒径为1～3μm。5.如权利要求4所述的一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，其特征在于：所述磁珠上汽巴兰的修饰密度为2～10mmol/L。6.如权利要求1至5任一项所述的一种分离血浆脂蛋白和外泌体的方法，其特征在于：在所述S2步骤中，使用微流控芯片分离所述脂蛋白和外泌体；其中，所述微流控芯片包括通道层和基底层，所述通道层位于所述基底层上；所述通道层包括顺次连通的进样区域和混合区域；所述进样区域包括进样口和进样通道，所述中间样品与所述含有汽巴兰的分离载体从所述进样口注入，并通过所述进样通道进入所述混合区域；所述混合区域包括若干个混合单元，每个所述混合单元包括至少1个宽通道和至少1个窄通道，所述宽...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱庆夫，娄豆豆，刘飞，
申请(专利权)人：温州医科大学附属眼视光医院，
类型：发明
国别省市：