无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用制造技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用。本发明专利技术提供的添加剂，各成分来源明确并协同配比，不同批次之间重复性好，临床安全性高，可取代血清、血小板裂解液等动物源成分，满足PBMC和T细胞等免疫细胞的体外培养需求。利用该添加剂制备的无血清培养基，能够实现对免疫细胞的高效培养，细胞增殖率高且细胞结团率低。低。低。

【技术实现步骤摘要】
无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用。

技术介绍

[0002]免疫细胞(immune cell)俗称白细胞，是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞等。
[0003]外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞(T、B、NK)、单核细胞等。T细胞为淋巴细胞的一种，其来自于人体骨髓的造血干细胞，其由胸腺迁移到胸腺内而分化成熟，然后进一步迁居到淋巴组织中。
[0004]近年来，由于T细胞常被应用于有关免疫系统或其相关范畴的实验研究，因而需要增殖出足够的T细胞。T细胞自身增值能力不强，而细胞培养常用的RPMI
‑
1640或DMEM培养基也无法提供T细胞生长必须的营养成分。为促进T细胞增殖，传统的方法是在RPMI
‑
1640或DMEM培养基中添加动物源成分，如以血清(人血清或胎牛血清)或血小板裂解液(PL)为基础支持T细胞体外扩增、传代培养。但是，不同批次的血清质量差异大，需要频繁筛选可能包含对T细胞扩张和存活有害的药剂；若采用人血清，一方面价格昂贵，另一方面还需要外源试剂检测可能新出现的感染因子。1965年第一个无血清培养基(SFM)被引入市场，基于此，从细胞培养基中消除血清来支持T细胞稳健的扩张和克隆选择成为该领域研究的新方向。
[0005]代谢免疫学的全新时代正在到来，在代谢和免疫相互联系的基础上研究免疫与代谢之间的相互作用，从这一角度出发，人们从淋巴细胞代谢与免疫的相互作用中已然清楚了解到：T细胞代谢如何影响T细胞功能；葡萄糖、谷氨酰胺和丝氨酸是T细胞扩张的必要营养素和功能；金属离子(如Ca
2+
和Zn
2+
)是蛋白质的重要辅因子，是细胞内信号的信使，等等。为此，开发出一种纯化学定义的无血清细胞培养基以使更多的免疫细胞强力膨胀及长期稳定增殖，将会获得更好的临床效益。

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题
[0007]鉴于现有技术存在的问题，例如，以血清或血小板裂解液(PL)为基础的细胞培养基因成分不明确、不同批次之间质量差异大从而影响免疫细胞相关性实验的缺陷。为此，本专利技术提供了一种无血清培养基的添加剂，其不含血清、血小板裂解液等成分，添加于无血清培养基中，来源明确、批次间差异小，能够实现对免疫细胞的高效培养。
[0008]用于解决问题的方案
[0009]本专利技术提供了一种无血清培养基的添加剂，其包括下列组分：以重量百分比计，含有基础代谢类物质的第一组分4.2％
‑
20％，含有细胞因子类物质的第二组分75.5％
‑
94.4％，以及含有氧化还原类物质的第三组分1.4％
‑
4.5％。
[0010]优选地，所述添加剂由下列组分组成：以重量百分比计，含有基础代谢类物质的第一组分4.2％
‑
20％，含有细胞因子类物质的第二组分75.5％
‑
94.4％，以及含有氧化还原类物质的第三组分1.4％
‑
4.5％。
[0011]优选地，所述第一组分包括葡聚糖硫酸钠、1
‑
硫代甘油、丙酮酸钠、柠檬酸铁胺、重组人胰岛素、乙醇胺、孕酮、肾上腺酮、甲状腺素和雌二醇中的一种或两种以上的组合。
[0012]进一步优选地，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：葡聚糖硫酸钠20
‑
500mg/L，1
‑
硫代甘油0.156
‑
3.9mg/L，丙酮酸钠22
‑
550mg/L，柠檬酸铁胺2
‑
50mg/L，重组人胰岛素0.8
‑
20mg/L，乙醇胺0.2
‑
5mg/L，孕酮0.126
‑
3.15mg/L，肾上腺酮0.04
‑
1mg/L，甲状腺素0.04
‑
1mg/L，雌二醇0.054
‑
1.35mg/L。
[0013]优选地，所述第二组分包括人血清白蛋白、转铁蛋白、白介素2、白介素15、LONGR3IGF
‑
1、IGF
‑
1和bFGF中的一种或两种以上的组合。
[0014]进一步优选地，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：人血清白蛋白1
‑
4g/L，转铁蛋白1
‑
25mg/L，白介素2 10
‑
100ng/mL，白介素15 10
‑
100ng/mL，LONGR3IGF
‑
1 5
‑
20ng/mL，IGF
‑
1 5
‑
20ng/mL，bFGF 10
‑
100ng/mL。
[0015]优选地，所述第三组分包括硫辛酸、生育酚、生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、谷胱甘肽、超氧化物酶、视黄醛、视黄醛乙酸酯、L
‑
抗坏血酸和2
‑
巯基乙醇中的一种或两种以上的组合。
[0016]进一步优选地，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：硫辛酸2.4
‑
60mg/L，生育酚0.2
‑
5mg/L，生育酚乙酸酯0.2
‑
5mg/L，过氧化氢酶0.5
‑
12.5mg/L，谷胱甘肽0.2
‑
5mg/L，超氧化物酶0.5
‑
12.5mg/L，视黄醛0.4
‑
10mg/L，视黄醛乙酸酯0.4
‑
10mg/L，L
‑
抗坏血酸10
‑
100mg/L，2
‑
巯基乙醇0.78
‑
7.8mg/L。
[0017]本专利技术还提供了一种无血清培养基，其包含上述的添加剂。
[0018]优选地，所述无血清培养基还包含基础培养基，所述基础培养基与所述添加剂的质量比为(3
‑
15):1。
[0019]优选地，所述基础培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、脂类、葡萄糖、HEPES和酚红。
[0020]进一步优选地，所述氨基酸包括甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或两种以上的组合。
[0021]进一步优选地，所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D
‑
泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无血清培养基的添加剂，其特征在于，其包括下列组分：以重量百分比计，含有基础代谢类物质的第一组分4.2％
‑
20％，含有细胞因子类物质的第二组分75.5％
‑
94.4％，以及含有氧化还原类物质的第三组分1.4％
‑
4.5％；优选地，所述添加剂由下列组分组成：以重量百分比计，含有基础代谢类物质的第一组分4.2％
‑
20％，含有细胞因子类物质的第二组分75.5％
‑
94.4％，以及含有氧化还原类物质的第三组分1.4％
‑
4.5％。2.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述第一组分包括葡聚糖硫酸钠、1
‑
硫代甘油、丙酮酸钠、柠檬酸铁胺、重组人胰岛素、乙醇胺、孕酮、肾上腺酮、甲状腺素和雌二醇中的一种或两种以上的组合；优选地，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：葡聚糖硫酸钠20
‑
500mg/L，1
‑
硫代甘油0.156
‑
3.9mg/L，丙酮酸钠22
‑
550mg/L，柠檬酸铁胺2
‑
50mg/L，重组人胰岛素0.8
‑
20mg/L，乙醇胺0.2
‑
5mg/L，孕酮0.126
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3.15mg/L，肾上腺酮0.04
‑
1mg/L，甲状腺素0.04
‑
1mg/L，雌二醇0.054
‑
1.35mg/L。3.根据权利要求1或2所述的添加剂，其特征在于，所述第二组分包括人血清白蛋白、转铁蛋白、白介素2、白介素15、LONGR3IGF
‑
1、IGF
‑
1和bFGF中的一种或两种以上的组合；优选地，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：人血清白蛋白1
‑
4g/L，转铁蛋白1
‑
25mg/L，白介素2 10
‑
100ng/mL，白介素15 10
‑
100ng/mL，LONGR3IGF
‑
15
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20ng/mL，IGF
‑
1 5
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20ng/mL，bFGF 10
‑
100ng/mL。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的添加剂，其特征在于，所述第三组分包括硫辛酸、生育酚、生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、谷胱甘肽、超氧化物酶、视黄醛、视黄醛乙酸酯、L
‑
抗坏血酸和2
‑
巯基乙醇中的一种或两种以上的组合；优选地，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：硫辛酸2.4
‑
60mg/L，生育酚0.2
‑
5mg/L，生育酚乙酸酯0.2
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5mg/L，过氧化氢酶0.5
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12.5mg/L，谷胱甘肽0.2
‑
5mg/L，超氧化物酶0.5
‑
12.5mg/L，视黄醛0.4
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10mg/L，视黄醛乙酸酯0.4
‑
10mg/L，L
‑
抗坏血酸10
‑
100mg/L，2
‑
巯基乙醇0.78
‑
7.8mg/L。5.一种无血清培养基，其包含根据权利要求1
‑
4任一项所述的添加剂。6.根据权利要求5所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基还包含基础培养基，所述基础培养基与所述添加剂的质量比为(3
‑
15):1。7.根据权利要求5或6所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、脂类、葡萄糖、HEPES和酚红；优选地，所述氨基酸包括甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或两种以上的组合；优选地，所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D
‑
泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12和对氨基苯甲酸中的一种或两种以上的组合；优选地，所述无机盐包括四水硝酸钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠和氯化钠一种或两种...

【专利技术属性】
技术研发人员：施坤宁，王星，孙振华，
申请(专利权)人：江苏普瑞康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：