一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，步骤如下：构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3

【技术实现步骤摘要】
一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]1993年，Hamers
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Casterman等在骆驼科动物血清中发现存在2种结构的免疫球蛋白：一种是传统的由2条重链和2条轻链组成的抗体；还有一种仅有2条重链(Nature.1993；363:446
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448.)。只克隆该抗体的重链可变区，即可得到单域抗体(single
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domain antibody,sdAb，也被称为纳米体，nanobody)，分子量约为15kD。sdAb结构稳定，具有较高的亲和力和抗原结合能力，相对分子质量小，容易穿透组织屏障，易于生产制备和进行基因工程改造，凭借其独特的优势得到了广泛的研究和关注(Journal of Biomedical Nanotechnology,2018,14(1):1
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19.)。例如，它可以作为蛋白结晶过程中的分子伴侣(Nature.2011；469(7329):175
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80.PNAS.2015；112(36):E4975
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84.Elife.2014；3:e03239.J Virol.2017；91(3):e01443
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16.Nature.2012；487(7405):119
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22.)；还能和其它蛋白融合表达，在细胞内操控其功能(FEBS Lett.1997；414(3):537
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40.J Control Release.2019；299:107
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120.；Artif Cells Nanomed Biotechnol.2020；48(1):854
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866.)，此外，在临床诊断和治疗中的实践也在积极地探索中(Adv Healthc Mater.2018；7(8):e1701156.FEBS J.2021Apr；288(7):2084
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2102.Nat Rev Drug Discov 2018；17(3):197
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223.)。
[0003]然而，对于特定抗原找到其亲和力高的抗体分子仍然面临较大挑战，为此，本申请人构建了基于sdAb骨架序列(complementarity
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determining region 3,CDR3)区域的随机文库，利用原位接近连接(insituproximityligationassay,isPLA)技术筛选来特异识别任意蛋白质分子抗原的sdAb。
[0004]sdAb的抗原互补决定区(complementarity
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determining region，CDR)决定其与相应抗原的亲和力(FEBS J.2021；288(7):2084
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2102.JCB 2015；209(5):633
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44.J Mol Biol.2005；352(3):597
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607.)。传统上，利用抗原免疫羊驼，分离羊驼的浆细胞，制备杂交瘤细胞，筛选出能产生特异识别抗原的sdAb的杂合细胞，用于后续sdAb分离、纯化和功能的验证。整个过程耗时长，所用实验材料较多，费用较高，使得得到高亲和力的sdAb的成功率极低。此外，基于已知抗体抗原决定区的氨基酸序列，工程化的sdAb研究也有一些报道，但这些研究是对已有抗体功能的进一步补充；而从头寻找新的特异性更高的sdAb的尝试还面临较大的挑战，缺乏在单细胞水平高亲和力、高特异性的筛选方法，有待开发。
[0005]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008]一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，步骤如下：
[0009]首先构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3
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Flag标签；将该文库质粒与带有HA标签的SQSTM1表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36h后，固定细胞进行isPLA；随后分选含有阳性红色荧光信号的细胞；这些细胞中质粒上含有编码sdAb的DNA序列，通过PCR对其进行扩增，随后将扩增得到的DNA片段重组到同一个sdAb表达载体上，形成sdAb的亚文库，进行下一轮的筛选；
[0010]筛选后，得到不同的识别SQSTM1的sdAb序列；接下来，构建依次包含谷胱甘肽S
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转移酶GST、烟草花叶病毒TEV蛋白酶切位点，识别SQSTM1的sdAb序列、假单胞菌外毒素ETA的易位结构域和3
×
Flag标签；在大肠杆菌BL21细胞中进行表达，随后经过GST亲和纯化和TEV蛋白酶酶切，得C端带有ETA易位结构域和Flag标签的识别SQSTM1的sdAb，即得利用isPLA高通量筛选的单域抗体。
[0011]进一步地，通过流式细胞仪分选含有阳性红色荧光信号的细胞。
[0012]进一步地，所述筛选为三轮筛选。
[0013]进一步地，筛选后，从260个随机挑选的克隆中得到24个不同的识别SQSTM1的sdAb序列。
[0014]进一步地，所述利用isPLA高通量筛选的单域抗体的DNA序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0015]进一步地，所述利用isPLA高通量筛选的单域抗体的DNA序列为SEQ ID NO.3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
[0016]如上所述的利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法在在单细胞中筛选到特异识别SQSTM1结构域的sdAbs方面中的应用。
[0017]如上所述的方法得到的单域抗体在作为抑制内源SQSTM1的分子来调控SQSTM1在细胞内的功能方面中的应用。
[0018]如上所述的方法得到的单域抗体在作为检测试剂用于体外的实验方面中的应用。
[0019]进一步地，所述体外的实验为免疫印迹和/或免疫细胞荧光实验。
[0020]本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：
[0021]1、本专利技术在单细胞水平，利用isPLA结合二代DNA测序技术开发一种高亲和力、高特异性的sdAb筛选方法。本方法能够从构建的高容量sdAb文库中筛选到特异性识别不同抗原决定簇的sdAbs，并且成本低、效率高。不涉及动物样本或杂交瘤的制备。
[0022]2、本专利技术方法从sdAb文库中高通量筛选特定识别蛋白抗原决定簇抗体，该方法得到的单域抗体能够高灵敏度检测sdAb和蛋白抗原在天然构象下单细胞内的相互作用。
[0023]3、由于sdAb和抗原分子的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，其特征在于：步骤如下：首先构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3
×
Flag标签；将该文库质粒与带有HA标签的SQSTM1表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36h后，固定细胞进行isPLA；随后分选含有阳性红色荧光信号的细胞；这些细胞中质粒上含有编码sdAb的DNA序列，通过PCR对其进行扩增，随后将扩增得到的DNA片段重组到同一个sdAb表达载体上，形成sdAb的亚文库，进行下一轮的筛选；筛选后，得到不同的识别SQSTM1的sdAb序列；接下来，构建依次包含谷胱甘肽S
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转移酶GST、烟草花叶病毒TEV蛋白酶切位点，识别SQSTM1的sdAb序列、假单胞菌外毒素ETA的易位结构域和3
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Flag标签；表达后经纯化和酶切，得C端带有ETA易位结构域和Flag标签的识别SQSTM1的sdAb，即得利用isPLA高通量筛选的单域抗体。2.根据权利要求1所述的利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，其特征在于：通过流式细胞仪分选含有阳性红色荧光信号的细胞。3.根据权利要求1所述的利用isPLA高通...

【专利技术属性】
技术研发人员：马振毅，刘喆，殷曰苑，严飞，周瑞敏，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：