脂肪酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脂肪酶突变体及其应用。通过在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基础上经过理性设计和几轮的酶进化筛选得到一系列脂肪酶突变体，相比母本脂肪酶发生了蛋白质结构和功能的改变，在实际应用时，脂肪酶突变体的立体选择性得到了极大的提高。脂肪酶突变体立体选择性的提高，在一定程度上降低了酶的用量，降低了后处理的难度，适合工业化生产。适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
脂肪酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及工业用酶领域，具体而言，涉及一种脂肪酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]目前在手性药物合成的工业应用上常用的方法有化学催化法和酶催化法。化学催化以碱金属为催化剂，其价格便宜、工艺成熟、相对来说容易大规模生产，但是该方法的反应有一定的随机性，存在选择性差、产物无特异性、副产物多、收率低等缺点。相比较而言，酶法催化具有催化条件温和、绿色环保、减少了反应副反应产物等优点。例如在酸、醇和酯类手性药物的拆分时就常用化学方法合成相应的甲酯、乙酯或丙酯等的消旋体，然后利用脂肪酶或酯酶进行立体选择性水解从而获得单一对映体构型的手性单元。
[0003]脂肪酶是一种广泛存在于动、植物、微生物中的酶，可以催化氨解、醇解、酯化、转酯化和酯类的逆向合成等反应。常用的脂肪酶包括猪胰脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单胞杆菌属脂肪酶和毛霉属脂肪酶(生物催化剂在手性药物合成中的应用[J].氨基酸和生物资源,2013,35(4):39
‑
42)。例如申请公布号为 CN 108642025 A的专利技术专利申请公开了来源于华根霉脂肪酶的突变体M8A、L10A、T9A的1,3
‑
位置选择性较野生型的酶提高了4.75 倍。该突变体在人乳脂替代品的催化反应中进行了应用，取得了显著的效果。
[0004]微生物来源的脂肪酶具有高度的立体选择性、催化温度范围广泛、转化效率高、副产物少等有点，常用于催化手性拆分、制备单一手性醇类、胺类和酯类等有机合成中间体（脂肪酶的固定化及其手性拆分的研究进展[J].应用化工,2011,40(10):1823
‑
1827）。例如除草剂（R）
‑
α
‑
苯氧基丙酯、抗炎药（S）
‑
苯基丙醇都是通过脂肪酶的立体选择性转化成单一的活性异构体。
[0005]然而，目前已有的商业化脂肪酶存在成本高的问题，在工业化生产尤其是在底物是以消旋体形式存在时，大多数野生型的脂肪酶立体选择性差，几乎不可能直接得到催化单一构型底物的野生型的工业酶，另外野生型的酶多数可能存在催化效率低、稳定性弱等缺点，因此能够真正被广泛应用的、具有良好立体选择性的脂肪酶并不多。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种脂肪酶突变体及其应用，以解决现有技术中工业用的脂肪酶立体选择性低的问题。
[0007]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种脂肪酶突变体，该脂肪酶突变体在SEQ ID NO：1基础上发生如下氨基酸突变：
；或者脂肪酶突变体的氨基酸序列在具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80%以上同源性，同时该脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。
[0008]进一步地，脂肪酶突变体的氨基酸序列与发生突变的氨基酸序列具有90%以上，优选为95%以上，更优选为99%以上同源性，同时该脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。
[0009]为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种DNA分子，编码上述脂肪酶突变体。
[0010]根据本专利技术的第三个方面，提供了一种重组质粒，重组质粒连接有上述DNA分子。
[0011]进一步地，重组质粒选自如下任意一种：pET
‑
21b（+）、pET
‑
22b（+）、pET
‑
3a（+）、pET
‑
3d（+）、pET
‑
11a（+）、pET
‑
12a（+）、pET
‑
14b、pET
‑
15b（+）、pET
‑
16b（+）、pET
‑
17b（+）、pET
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19b（+）、pET
‑
20b（+）、pET
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21a（+）、pET
‑
23a（+）、pET
‑
23b（+）、pET
‑
24a（+）、pET
‑
25b（+）、pET
‑
26b（+）、pET
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27b（+）、pET
‑
28a（+）、pET
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29a（+）、pET
‑
30a（+）、pET
‑
31b（+）、pET
‑
32a（+）、pET
‑
35b（+）、pET
‑
38b（+）、pET
‑
39b（+）、pET
‑
40b（+）、pET
‑
41a（+）、pET
‑
41b（+）、pET
‑
42a（+）、pET
‑
43a（+）、pET
‑
43b（+）、pET
‑
44a（+）、pET
‑
49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET
‑
A、pRSET
‑
B、pRSET
‑
C、pGEX
‑
5X
‑
1、pGEX
‑
6p
‑
1、pGEX
‑
6p
‑
2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232
‑
8、pUC
‑
18以及pUC
‑
19。
[0012]根据本专利技术的第四个方面，提供了一种非植物的宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
[0013]进一步地，宿主细胞为原核细胞或真核细胞，真核细胞为酵母细胞。
[0014]进一步地，宿主细胞为感受态细胞。
[0015]进一步地，感受态细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌W3110。
[0016]根据本专利技术的第五个方面，提供了一种手性化合物的制备方法，该制备方法包括：利用上述任一种脂肪酶突变体催化式I所示的酯类化合物发生水解为式II所示的酸类化合物和式III所示的醇类化合物；，其中，R1选自如下任意一种：CH3、 CH2CH3、CH2‑
CH2CH3或CHCH3CH3，R2、R3、R4和R5各自独立地选自如下任意一种：H、F、Cl、Br、I、OH、CH3或CH2CH3，环己烷环中存在或不存在双键，当存在时，双键形成于如下任意一处或多处：R3和R4之间、R5和R6之间、R7和R8之间及R9和R
10
之间。
[0017]进一步地，酯类化合物为如下任意一种：、、、、及。
[0018]进一步地，脂肪酶突变体在15℃~30℃的温度下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体在SEQ ID NO：1基础上发生如下氨基酸突变：；或者，脂肪酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点且与发生突变的氨基酸序列具有80%以上同源性，同时所述脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。2.根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列与发生突变的氨基酸序列具有90%以上同源性，同时所述脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。3.根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列与发生突变的氨基酸序列具有95%以上同源性，同时所述脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。4.根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列
与发生突变的氨基酸序列具有99%以上同源性，同时所述脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。5.根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列与发生突变的氨基酸序列具有99.5%以上同源性，同时所述脂肪酶突变体来源于Pseudomonas putida且具有脂肪酶活性。6.一种DNA分子，其特征在于，编码权利要求1至5中任一项所述的脂肪酶突变体。7.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求6所述的DNA分子。8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒选自如下任意一种：pET
‑
21b（+）、pET
‑
22b（+）、pET
‑
3a（+）、pET
‑
3d（+）、pET
‑
11a（+）、pET
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12a（+）、pET
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14b、pET
‑
15b（+）、pET
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16b（+）、pET
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17b（+）、pET
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19b（+）、pET
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20b（+）、pET
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21a（+）、pET
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23a（+）、pET
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23b（+）、pET
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24a（+）、pET
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25b（+）、pET
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26b（+）、pET
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27b（+）、pET
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28a（+）、pET
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29a（+）、pET
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30a（+）、pET
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31b（+）、pET
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32a（+）、pET
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35b（+）、pET
‑
38b（+）、pET
...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：