一种印迹脂肪酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种印迹脂肪酶及其应用。本发明专利技术公开一种制备印迹脂肪酶的方法，包括以高光学纯度L-乳酸作为印迹模板对脂肪酶进行生物印迹的步骤。本发明专利技术将该印迹脂肪酶用于发酵制备L-乳酸，得到的L-乳酸光学纯度高，并且不需要对菌株进行改造，操作简便，成本低廉，能够适用于高光学纯度L-乳酸的工业化生产。乳酸的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种印迹脂肪酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种印迹脂肪酶及其应用，特别是印迹脂肪酶在发酵法制备高光学纯度L-乳酸中的应用。

技术介绍

[0002]乳酸，又称α-羟基丙酸，是自然界中的三大有机酸之一，作为一种重要原料被广泛地应用于食品、药品、化工和材料等领域。近年来，随着温室效应和环境污染的加剧，由乳酸单体聚合制备的聚乳酸(PLA)材料广泛受到人们的关注。聚乳酸能够在特定条件下降解为小分子，产生二氧化碳和水，能够缓解白色污染造成的环境压力，改善生态环境。并且聚乳酸安全无毒，抗菌透气，具有良好的力学性能和加工性能，可用于食品包装袋、餐盒、纺织品、工程塑料等。因此，聚乳酸材料已经逐渐成为一项市场广阔的可降解塑料产品。乳酸按照旋光度可以分为L型和D型，乳酸单体的光学纯度决定着聚乳酸的物理性质和使用性能，一般要求单体的光学纯度达到99.5％以上。因此随着生物可降解塑料的推广，高光学纯度L-乳酸的需求量也将逐渐增大。
[0003]目前，L-乳酸的主流制备方法为发酵法。某些微生物(如乳酸杆菌、芽孢杆菌、米根霉等)在特定的温度和通氧条件下将葡萄糖或淀粉原料转化为乳酸产品。与化学法相比，发酵法具有原料成本低、环保、低污染等优势。但是，微生物在发酵过程中的代谢产物比较复杂，除了L-乳酸之外还有少量D-乳酸，它们会影响乳酸的光学纯度，进而影响聚乳酸的品质和应用性能。通过普通的化工分离单元操作很难将光学异构体分开。
[0004]手性拆分，是指通过合适的拆分方法来分离光学异构体混合物，得到需要的手性物质的构型的方法。手性拆分方法主要有色谱法、酶法、结晶法、化学拆分法等等，其中酶法拆分是指利用酶的特异性与酶与光学异构体之间能相互识别，先生成不同的衍生化合物，再把异构体相互分开，该方法具有众多的优点：商业酶种类广泛选择多、成本低廉，在有机溶剂中稳定性好、选择性高，催化条件温和、环境污染小，操作简便等。以往的酶法拆分主要是应用天然酶分子，例如用青霉素酰化酶制备(S)-2-氨基丁醇，天然酶分子受限于种类，能够制备的产品种类很少。近年来，随着分子印迹酶技术的快速发展，酶可以“记忆”目标分子的构型，从而制备更多种类构型的分子。生物印迹首先将酶与模板分子共溶于溶液中，使得酶改变构象与配体有机结合，处于激活状态，然后通过冷冻干燥或固定化技术将这种活性构象固定，再将模板洗去。最终得到的生物印记酶可保持这一高活性构象。生物印迹酶的最大优势在于可以“按需设计”其结构，可根据目标产物的需求，对印迹模板进行筛选，从而得到具有更高特异选择性的印迹酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术主要解决的技术问题是现有的乳酸发酵产品中L-乳酸光学纯度较低(一般只有98％)，杂质含量多，分离困难的问题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种制备印迹脂肪酶的方法，包括以高光学纯
度L-乳酸作为印迹模板对脂肪酶进行生物印迹的步骤；
[0007]所述高光学纯度L-乳酸的光学纯度为99.5％以上。
[0008]在一个实施方案中，上述方法中，所述生物印迹包括将所述脂肪酶溶解在缓冲液中，加入所述高光学纯度L-乳酸作为印迹模板，混匀，冷冻后冻干，再加入碳原子数为1-4的醇洗涤除去印迹模板，同时沉淀得到印迹脂肪酶的步骤。
[0009]在一个实施方案中，上述方法中，所述脂肪酶与所述高光学纯度L-乳酸的质量比为1:5-3:1。
[0010]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述脂肪酶与所述缓冲液的质量体积比为10mg:1ml-50mg:1ml。
[0011]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述碳原子数为1-4的醇与所述缓冲液的体积比为5:1-10:1。
[0012]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述脂肪酶为天然来源的脂肪酶，优选为南极假丝酵母脂肪酶B、猪胰腺脂肪酶或黑曲霉脂肪酶。
[0013]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述缓冲液为磷酸缓冲液，优选为pH7.0,10mM的磷酸缓冲液。
[0014]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述碳原子数为1-4的醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇，优选为异丙醇。
[0015]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述混匀条件为4℃、300-500rpm混匀20-40min。
[0016]在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，在沉淀得到印迹脂肪酶后还包括将酶液进行干燥的步骤。
[0017]为解决上述技术问题，本专利技术还提供根据上述任一所述的方法制备得到的印迹脂肪酶。
[0018]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种将上述印迹脂肪酶进行固定的方法，该方法采用交联酶聚体技术对印迹脂肪酶进行固定，包括在所述印迹脂肪酶的溶液中加入交联剂，混匀，离心得到沉淀分子印迹化交联酶聚体的步骤；
[0019]优选地，所述交联剂为SMCC(含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂)。
[0020]在一个实施方案中，上述固定方法中，所述印迹脂肪酶的溶液为印迹脂肪酶的异丙醇溶液。
[0021]在一个实施方案中，上述任一所述的固定方法中，所述SMCC的添加量为0.05-0.1g/100ml异丙醇。
[0022]在一个实施方案中，上述任一所述的固定方法中，所述混匀的条件为300-500rpm混匀20-40min。
[0023]在一个实施方案中，上述任一所述的固定方法中，所述离心得到沉淀之后还有用有机溶剂(优选为异丙醇)离心洗涤沉淀的步骤。
[0024]为解决上述技术问题，本专利技术还提供上述任一所述的方法制备得到的分子印迹化交联酶聚体；所述分子印迹化交联酶聚体的酶活为20-100U。
[0025]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种用发酵法制备高光学纯度L-乳酸的方
法，包括将产乳酸的菌种进行发酵，在无氧发酵过程中加入上述分子印迹化交联酶聚体和乙醇，使得所述分子印迹化交联酶聚体中的印迹脂肪酶特异性催化发酵液中的L-乳酸与乙醇反应得到L-乳酸乙酯，发酵结束后将发酵液中的菌体去除，再将去除菌体后的发酵液通过溶剂萃取提取L-乳酸乙酯，通过反应精馏水解L-乳酸乙酯得到高光学纯度L-乳酸；所述分子印迹化交联酶聚体中的印迹脂肪酶不催化D-乳酸与乙醇反应。
[0026]在一个实施方案中，上述发酵方法中，所述菌种为乳酸杆菌(Lactobacillus)属的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，大肠杆菌(Escherichia coli)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备印迹脂肪酶的方法，包括以高光学纯度L-乳酸作为印迹模板对脂肪酶进行生物印迹的步骤；所述高光学纯度L-乳酸的光学纯度为99.5％以上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物印迹包括将所述脂肪酶溶解在缓冲液中，加入所述高光学纯度L-乳酸作为印迹模板，混匀，冷冻后冻干，再加入碳原子数为1-4的醇洗涤除去印迹模板，同时沉淀得到印迹脂肪酶的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述脂肪酶与所述高光学纯度L-乳酸的质量比为1:5-3:1；和/或所述脂肪酶与所述缓冲液的质量体积比为10mg:1ml-50mg:1ml；和/或；所述碳原子数为1-4的醇与所述缓冲液的体积比为5:1-10:1。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的印迹脂肪酶。5.一种将权利要求4所述的印迹脂肪酶进行固定的方法，该方法采用交联酶聚体技术对印迹脂肪酶进行固定，包括在所述印迹脂肪酶的溶液中加入交联剂，混匀，离心得到沉淀分子印迹化交联酶聚体的步骤；优选地，所述交联剂为SMCC。6.根据权利要求5所述的方法制备得到的分子印迹化交联酶聚体。7.一种用发酵法制备高光学纯度L-乳酸的方法，包括将产乳酸的菌种进行发酵，在无氧发酵过程中加入权利要求6所述的分子印迹化交联酶聚体和乙醇，使得所述分子印迹化交联酶聚体中的印迹脂肪酶特异性催化发酵液中的L-乳酸与乙醇反应得到L-乳酸乙酯，发酵结束后将发酵液中的菌体去除，再将去除菌体后的发酵液通过溶剂萃取提取L-乳酸乙酯，通过反应精馏水解L-乳酸乙酯得到高光学纯度L-乳酸。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述菌种为乳酸杆菌(Lactobacillus)属的嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophi...

【专利技术属性】
技术研发人员：单雨瑶，王竞辉，吴计划，杨付伟，张稳，陈长生，王坤，黎源，孔令晓，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：