耐甲醇脂肪酶制造技术

本申请提供了新的具有脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列或上述序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列。本申请还提供了编码所述多肽的多核苷酸、含有上述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。本文公开的多肽能够在高温及高甲醇浓度下快速地制备脂肪酸甲酯，进而用于生物柴油的制备。物柴油的制备。物柴油的制备。

【技术实现步骤摘要】
耐甲醇脂肪酶
专利

[0001]本申请属于酶工程领域，具体地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其编码核酸，以及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。本申请还涉及上述多肽的筛选方法及其用途。
[0002]专利技术背景
[0003]脂肪酶(Lipase EC 3..1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。
[0004]它能够催化油脂上甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产,其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。目前，已知大约有2％的微生物产脂肪酶，能产脂肪酶的微生物至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属。疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶Thermomyces lanuginosus lipase(TL)，TL能够被用来进行脂肪酸甲酯话反应生产生物柴油。因为反应过程中甲醇是其中的一种底物，进一步提高TL的耐甲醇能力，有可能进一步使其更加适合甲酯化反应，比如降低用量。
[0005]专利技术概述
[0006]第一方面，提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
[0007](a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及
[0008](b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。
[0009]在一实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:4和6任一项所示的氨基酸序列组成。
[0010]第二方面，提供了编码第一方面所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
[0011](a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列、或在SEQ ID NO:4或6中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及
[0012](b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
[0013]在一实施方案中，本申请的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，上述多核苷酸由SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列组成。
[0014]第三方面，提供了表达载体，其包含至少一种第二方面所述的多核苷酸。
[0015]在某些实施方案中，本申请的表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。在具体的实施方案中，所述表达载体为质粒载体。
[0016]第四方面，提供了包含第二方面的多核苷酸或第三方面的表达载体的宿主细胞。
[0017]在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌、或者酵母例如毕赤酵母。
[0018]第五方面，提供了第一方面所述的多肽用于进行脂肪酸甲酯化反应或用于制备生物柴油的用途。
[0019]在一些实施方案中，在不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的甲醇环境进行脂肪酸甲酯化反应或制备生物柴油。
[0020]第六方面，提供了制备生物柴油的方法，其包括将第一方面所述的多肽与油脂原料和低级醇进行接触。
[0021]在一些实施方案中，所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇或者其任意组合。
[0022]在一些实施方案中，第一方面所述的多肽与油脂原料和低级醇在不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的低级醇环境下进行接触，在一些实施方案中，低级醇为甲醇。
[0023]第七方面，提供了筛选本申请的多肽的方法，其包括：
[0024]1)将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行突变，得到突变序列，
[0025]2)将步骤1)中获得的突变序列克隆在表达载体上，然后转化或转导至合适的宿主细胞中，
[0026]3)培养步骤2)中的宿主细胞，回收重组表达载体，然后将其转化至酵母菌株中培养，以及
[0027]4)筛选耐甲醇性能高于SEQ ID NO:2所示的多肽的突变多肽。
[0028]另外，本申请还提供了SEQ ID NO:1所示的核酸序列用于筛选本文公开的多肽的用途。
[0029]本申请的多肽具有较好的甲醇稳定性，特别的，本申请的多肽在高温(例如50℃)环境下具有较好的甲醇稳定性，其中，在50℃、30％甲醇浓度条件下，G2-4D的甲醇稳定性相比于野生型提高了1.56倍，突变体A12的甲醇稳定性相比于野生型提高了1.64倍。
[0030]附图简要说明
[0031]图1显示了TL、G2-4D和A12在50℃和30％甲醇条件下的稳定性。
[0032]图2显示了TL、G2-4D和A12在50℃的稳定性。
[0033]图3显示了脂肪酶活力检测方法。
具体实施方式
[0034]本申请的多肽
[0035]本申请提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
[0036](a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及
[0037](b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。
[0038]在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个，其中获得的多肽变体基本上保持未改变的蛋白的脂肪酶活性。
[0039]在某些实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在优选的实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO:4
或6所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。
[0040]在一些实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列组成。
[0041]在一些实施方案中，在所述多肽的氨基酸序列中发生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸的保守性取代。进行保守性取代后的多肽基本上保持原多肽的脂肪酶活性。本领域的技术人员熟知具体可实施的保守型取代。
[0042]在其他实施方案中，所述多肽的C端或N端可以缺失约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然具有脂肪酶活性。
[0043]在另外的实施方案中，还可以在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。2.如权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，优选地，所述多肽由SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列组成。3.编码权利要求1或2所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)核苷酸序列，其编码如权利要求1(a)或1(b)所述的氨基酸序列；以及(b)在严格条件下与(a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列，优选地，所述多核苷酸由SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列组成。5.表达载体，其包含至少一种权利要求3或4所述的多核苷酸。6.如权利要求5所述的表达载体，其还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接，优选地，所述表达载体为质粒。7.宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣姚吉，牛其文，贾青杰，徐正军，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：