新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了新型mlCas12a蛋白及其在核酸检测方面的应用。本发明专利技术研究发现一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型mlCas12a蛋白，可作为新型CRISPR/mlCas12a系统应用于核酸检测，为基于CRISPR/Cas12a的分子检测方法提供了一种新的必要工具选择。同时提供了一种包括mlCas12a蛋白和gRNA的新型核酸检测系统和试剂盒，可在25℃

【技术实现步骤摘要】
新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种新型mlCas12a蛋白在核酸检测方面的应用。

技术介绍

[0002]2015年，一种全新的第二类CRISPR-Cas系统-V型系统被发现，该系统中的效应蛋白被命名为Cpf1/Cas12a。张锋团队于2015年11月22日在《Cell》发表的一篇题为“Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas system”的文章。该系统基本的工作流程与CRISPR/Cas9类似，还是借助CRISPR序列的“黑名单”系统对入侵者进行打击。但是gRNA形成的方式与CRISPR/Cas9系统不同：Cpf1/Cas12a蛋白会与未成熟的gRNA复合，并对gRNA进行加工，gRNA则会与PAM附近的互补区域杂交。最后，外源双链DNA（double strand DNA，dsDNA）会被剪切，其基因表达也会被沉默。然而，在切割靶dsDNA的同时，激活了的Cpf1/Cas12a还会降解靶dsDNA邻近的单链DNA（single strand DNA，ssDNA），称之为“附属切割”，这种活性是新开发的核酸检测平台的关键特征。2018年4月27日，Doudna团队和张锋团队同时在《Science》发表了两篇题为“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”和“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”的论文。表明Cpf1/Cas12a在切割靶dsDNA的同时，还会降解靶dsDNA邻近的ssDNA。这两个独立的实验室分别改造了靶向dsDNA的V型CRISPR系统，使其成为了快速、便宜且高度灵敏的诊断工具。这一发现有望为科学研究以及全球公共卫生带来变革性的影响。利用这种新的CRISPR技术：CRISPR-Cpf1/Cas12a，可以高灵敏度检测包括寨卡病毒感染，登革热病毒感染等在内的疾病，其原理在于将CRISPR-Cpf1/Cas12a与等温核酸扩增结合，检测特异性的RNA或DNA。另外，该系统还包含有一个切割时发出荧光的报告ssDNA。当Cpf1/Cas12a检测到靶标dsDNA序列时，其ssDNase活性就会切割报告ssDNA，释放可检测的荧光信号。将这两种技术结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和单DNA分子，具有很好的应用前景。另外根据张锋团队的研究结果显示，Cpf1/Cas12a蛋白同族间具有较大的差异，某些同族蛋白无活性。

技术实现思路

[0003]本专利技术涉及一种用于核酸检测的mlCas12a蛋白或其功能变体，所述mlCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述mlCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0004]本专利技术还涉及一种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统，包括上述的mlCas12a蛋白或其功能变体，还包括gRNA。
[0005]本专利技术还涉及基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统的核酸检测方法，其利用上述的mlCas12a蛋白或其功能变体、对应靶标序列的gRNA进行CRISPR核酸检测。
[0006]本专利技术还涉及上述mlCas12a蛋白或其功能变体的应用，包括：
Harlow )和拉内( Lane )编辑( 1988 )《抗体：实验室手册》( ANTIBODIES ,A LABORATORY MANUAL )，以及《动物细胞培养》( ANIMAL CELL CULTURE )(R .I .弗雷谢尼(R .I .Freshney )编辑(1987 ))。
[0020]如下述实施例中所用的异丙基硫化-D-半乳糖苷（IPTG）购买自Sigma公司。Ni Sepharose FF购买自GE Healthcare。蛋白纯化耗材购买自碧云天公司。Amicon 4 30kDa超滤管购买自Millipore公司。Phusion DNA聚合酶、FastDigestNotI、FastDigestAscI内切酶、T4连接酶购买自Thermo公司。PCR clean up和凝胶回收试剂盒均购买自Qiagen公司。
[0021]如本文所用，术语“gRNA”是指向导RNA，其引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA。
[0022]如本文所用，术语“CRISPR”是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。
[0023]如本文所用，术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型(type V-A)的酶。
[0024]如本文所用，术语“PAM”是指靶向序列邻近的前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif），是CRISPR/Cas系统特异识别靶DNA的重要组成部分。
[0025]如本文所用，术语“Cas核酸酶”是能够在gRNA的配合下特异性切割靶序列（DNA或RNA）的酶。
[0026]本专利技术的第一方面在于提供一种用于核酸检测的mlCas12a蛋白或其功能变体，所述mlCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述mlCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0027]本专利技术为基于Cas12a的核酸分子检测提供了一种必要工具的新选择，提供一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型CRISPR/Cas12a系统的蛋白
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mlCas12a蛋白，可应用于特异性核酸检测。
[0028]另外，除了本专利技术所述的mlCas12a蛋白本身，其功能变体或其同源物或直向同源物皆有可能保留部分或全部蛋白质活性，即mlCas12a蛋白的功能变体或其同源物或直向同源物的应用，也应在本专利技术的范围之内。
[0029]所述功能变体可以包括mlCas12a突变体（可以是插入，缺失或替换序列的突变体）、多晶型等。所述功能变体也包括mlCas12a蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质或多肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的，也可以是人造的。
[0030]因此，mlCas12a蛋白或其功能变体的应用均应在本专利技术的范围之内：在切割DNA方面的应用；在作为或制备DNA切割工具方面的应用；在核酸检测方面的应用；在基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方面的应用；在作为或制备核酸检测工具方面的应用；在作为或制备基于CR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸检测的mlCas12a蛋白，其特征在于，所述mlCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述mlCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。2.一种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统，其特征在于，包括权利要求1所述的mlCas12a蛋白和gRNA。3. 如权利要求2所述的核酸检测系统，其特征在于，所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述与 Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO.10~ 15中至少一种所示。4. 如权利要求2所述的核酸检测系统，作为一种可选择的案例，当靶序列如SEQ ID NO.4所示时，gRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。5.一种基于权利要求2～4任一所述系统的核酸检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的mlCas12a蛋白和对应靶标序列的gRNA进行CRISPR核酸检测。6.一种基于权利要求2～4任一所述系统的核酸检测方法，其特征在于，核酸检测最终结果的获取通过可视化方法实现，所述可视化方法为基于所述mlCas12a蛋白附属切割活性的荧光信号检测方式、所述mlCas12a蛋白附属切割活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华勇，陈翀，季宇，谢婵芳，黄嘉恩，
申请(专利权)人：广州美格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：