本发明专利技术公开了一种新型嵌合体TsCas12a蛋白序列及制备技术。本发明专利技术研究发现一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型嵌合体Cas12a蛋白，作为新型CRISPR/TsCas12a系统应用于核酸检测，可在含有高浓度PEG、多种非离子型去垢剂和还原剂的反应体系中正常工作，为基于Cas12a的一步法分子检测提供了一种新的必要工具选择。法分子检测提供了一种新的必要工具选择。法分子检测提供了一种新的必要工具选择。
【技术实现步骤摘要】
一种新型嵌合体TsCas12a蛋白及制备技术
[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种新型嵌合体TsCas12a蛋白及制备技术。
技术介绍
[0002]在2015年，一种全新的第二类CRISPR
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Cas系统
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V型系统被发现，该系统中的效应蛋白被命名为Cpf1/Cas12a。2018年4月27日，Doudna团队和张锋团队同时在《Science》发表了两篇题为“Two distinct RNase activities of CRISPR
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C2c2 enable guide
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RNA processing and RNA detection”和“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”的论文。表明Cpf1/Cas12a具有两种不同的核酸酶活性，Cpf1/Cas12a在切割靶dsDNA的同时，还会降解靶dsDNA邻近的ssDNA。利用这种新的CRISPR技术：CRISPR
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Cpf1/Cas12a，可以高灵敏度检测包括寨卡病毒感染，登革热病毒感染等在内的疾病，其原理在于将CRISPR
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Cpf1/Cas12a与等温核酸扩增结合，检测特异性的RNA或DNA。另外，该系统还包含有一个切割时发出荧光的报告ssDNA。当Cpf1/Cas12a检测到靶标dsDNA序列时，其ssDNase活性就会切割报告ssDNA，释放可检测的荧光信号。将这两种技术结合起来的新系统能够以极低浓度检测RNA和单链DNA分子，具有很好的应用前景。根据张锋团队的研究结果显示，Cpf1/Cas12a蛋白同族间具有较大的差异，某些同族蛋白无活性。目前报道使用较多的lbaCas12a蛋白，其活性在含有高浓度PEG、非离子型去垢剂和还原剂的体系中无法正常工作。限制了其与多种等温扩增系统同时工作，对恒温扩增系统和Cas12a检测系统一管法的开发造成较大的困难。
技术实现思路
[0003]本专利技术涉及一种用于核酸检测的嵌合体TsCas12a蛋白。
[0004]所述TsCas12a蛋白Wedge region I区域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TsCas12a蛋白Wedge region I区域核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0005]所述TsCas12a蛋白Recognition domain I区域氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述TsCas12a蛋白Recognition domain I区域核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0006]所述TsCas12a蛋白Recognition domain II区域氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述TsCas12a蛋白Recognition domain II区域核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0007]所述TsCas12a蛋白Wedge region II区域氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述TsCas12a蛋白Wedge region II区域核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
[0008]所述TsCas12a蛋白PAM
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interacting domain区域氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述TsCas12a蛋白PAM
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interacting domain区域核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
[0009]所述TsCas12a蛋白Wedge region III区域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述TsCas12a蛋白Wedge region III区域核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
[0010]所述TsCas12a蛋白RuvC I区域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述TsCas12a蛋
白Wedge RuvC I区域核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
[0011]所述TsCas12a蛋白Bridge helix区域氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述TsCas12a蛋白Bridge helix区域核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
[0012]所述TsCas12a蛋白RuvC II区域氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述TsCas12a蛋白RuvC II区域核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
[0013]所述TsCas12a蛋白Nuclease domain区域氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述TsCas12a蛋白Nuclease domain区域核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
[0014]所述TsCas12a蛋白RuvC
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III区域氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述TsCas12a蛋白RuvC
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III区域核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
[0015]所述TsCas12a蛋白全长氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述TsCas12a蛋白全长核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
[0016]本专利技术还涉及上述TsCas12a蛋白的应用，包括：在核酸检测方面的应用；在基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方面的应用；本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现一种新型嵌合体Cas12a蛋白，可作为新型CRISPR/TsCas12a系统应用于核酸检测，为基于Cas12a的核酸分子检测提供了一种必要工具的新选择。
[0017]而且基于TsCas12a蛋白的核酸检测系统可在高浓度PEG、非离子型去污剂和还原剂存在的体系中实现高灵敏、高精度的分子检测，将有利于该新型CRISPR/TsCas12a系统与其余多种恒温扩增一步法联用方案的开发。
附图说明
[0018]图1为TsCas12a蛋白质粒设计图。
[0019]图2为TsCas12a基因片段扩增结果。
[0020]图3为TsCas12a蛋白表达结果。
[0021]图4为TsCas12a蛋白纯化结果。
[0022]图5为基于CRISPR/TsCas12a在含有5% PEG
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8K的体系中核酸检测结果。
[0023]图6为基于CRISPR/TsCas12a 在含有2%Tritonx
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100的体系中核酸检测结果。
[0024]图7为基于CRISPR/TsCas12a在含有2%NP
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40的体系中核酸检测结果。
[0025]图8为基于CRISPR/TsCas12a在含有2%Tween
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20的体系中核酸检测结果。
[0026]图9为基于CRISPR/TsCas本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新型嵌合体TsCas12a蛋白及制备技术，其特征在于，所述嵌合体TsCas12a蛋白氨基酸序列多个功能区域由SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.11组合而成；和/或，所述嵌合体TsCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.12
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SEQ ID NO.22所示。2.如权利要求1所述新型嵌合体TsCas12a蛋白及制备技术，其特征在于，所述嵌合体TsCas12a蛋白氨基酸序列全长如SEQ ID NO.23所示；和/或，所述嵌合体TsCas12a蛋白核苷酸序列全长如SEQ ID NO.24所示。3.如权利要求2所述新型嵌合体TsCas12a蛋白及制备技术，其特征在于，所述嵌合体TsCas12a蛋白全长核苷酸序列导入pET
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28
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ccdB
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CmR载体中，并转入大肠杆菌进行诱导表达，通过亲和层及凝胶过滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：松阳洲，韩延华，卢蜜雨，
申请(专利权)人：广州美格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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