一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于酶工程领域，公开了一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用，脂肪酶嵌合体氨基酸序列如SEQ NO.1所示，编码脂肪酶嵌合体的基因核苷酸序列如SEQ NO.2所示。构建方法如下：(1)pcr扩增出GMGL的N端前160个氨基酸肽段；(2)无缝克隆方式将步骤(1)的氨基酸肽段替换到CoMGL对应肽段得到重组质粒；(3)将测序成功的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞内进行异源表达与纯化，得到脂肪酶嵌合体160。改造后的嵌合体160在最适条件的比酶活为741.8U/mg，是野生型CoMGL的4.9倍，是野生型GMGL的2.7倍；最适反应温度为70℃，具有良好的工业应用前景。工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]甘油单酯在工业中具有重要意义，在化妆品行业，由于其良好的乳化效果，甘油单酯常作为乳化剂添加到护肤乳霜和发乳中；在医药领域，含有多不饱和脂肪酸的单甘酯(EPA,DHA)对于心血管疾病具有预防作用；月桂酸单甘酯具有防腐作用，在食品行业中常被用来作为防腐剂延长食品保质期。脂肪酶是在1856年由Claude Bernard首次发现的，它使用类似于酯酶的亲核机制来催化不同底物的水解和合成反应。(Woolley P V,Petersen S B,Industrifond N.Lipases:their structure,biochemistry and application[J].1994.)脂肪酶催化反应具有催化效率高、反应条件温和和副产物少的优点，因此在工业应用中有巨大的价值。甘油单酯脂肪酶(MGL)是一种具有特异底物选择性的脂肪酶，其只能够水解甘油单酯，生成甘油和对应的脂肪酸，而不能催化甘油二酯和甘油三酯的水解。在催化甘油和脂肪酸的合成反应中也只能生成甘油单酯而不能生成甘油二酯和甘油三酯。
[0003]在工业生产中，有很多反应需要在高温或者中高温下进行且需要反应较长时间，而很多耐热性较差的脂肪酶在遇到高温时则会迅速变性失活，这大大限制了他们在工业中的应用，因此许多野生型的脂肪酶并不能直接使用于工业应用，而需要先进行一定的分子改造。
[0004]现有的针对酶的热稳定性的改造技术不能同时起到提高比酶活的效果，例如，Mitsutaka等人采用易错PCR技术对来源于Rhizopus niveus的脂肪酶进行突变来提高酶的最适反应温度，最终筛选出了一个含有三个突变位点(P18H、A36T和E218V)的最佳突变体，最适温度提高了15℃，但纯化后突变型脂肪酶的比酶活是野生型的80％。(Kohno M,Enatsu M,Funatsu J,et al.Improvement of the optimum temperature of lipase activity for Rhizopus niveus by random mutagenesis and its structural interpretation[J].Journal of Biotechnology,2001,87(3):203
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210.)。Jeong等人通过使用二硫键设计程序(Disulfide by design TM)对Bacillus stearthermophilus No.236进行了二硫键的设计，来识别具有二硫键形成几何特征的残基对，并最终筛选出一对(Ser100和Asn150)，将这两个氨基酸分别替换成半胱氨酸，结果表明突变体的T
50(20min)
比野生型提高了5℃，但催化活力没有变化。(Jeong M Y,Kim S,Yun C W,et al.Engineering a de novo internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from Bacillus stearothermophilus No.236[J].Journal of Biotechnology,2007,127(2):300
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309.)
[0005]因此，需开发一种耐高温、高酶活的甘油单酯脂肪酶，来解决目前甘油单酯脂肪酶催化效率和温度耐受性不足以达到工业要求的问题。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术公开了一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用，构建得到了一种能适合工业使用的，同时具有高温度耐受性和高催化活力的甘油单酯脂肪酶。
[0007]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0008]一种海洋微生物脂肪酶嵌合体，所述脂肪酶嵌合体氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
[0009]一种编码脂肪酶嵌合体的基因。
[0010]优选地，所述基因核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
[0011]含有编码脂肪酶嵌合体基因的重组质粒。
[0012]含有重组质粒的重组菌。
[0013]一种构建所述海洋微生物脂肪酶嵌合体的方法，包括下列步骤：
[0014](1)通过pcr扩增出GMGL的N端前160个氨基酸肽段；
[0015](2)通过无缝克隆的方式将步骤(1)所述的氨基酸肽段替换到CoMGL对应肽段，得到重组质粒；
[0016](3)将测序成功的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞内进行异源表达与纯化，得到脂肪酶嵌合体160。
[0017]脂肪酶嵌合体160在食品、化妆品、医疗方面的应用。
[0018]本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术以两种海洋芽孢杆菌来源的甘油单酯脂肪酶为基础，通过拼接重组装的方式改造出了一种新型嵌合体，改造后的酶催化效率和温度耐受性都有显著提升，改造后的新酶在最适条件的比酶活为741.8U/mg，是野生型CoMGL最适条件下测定比酶活的4.9倍，是野生型GMGL最适条件下测定比酶活的2.7倍；最适反应温度为70℃，比野生型CoMGL的最适反应温度提高了20℃，比野生型GMGL的最适反应温度提高了10℃，为开发工业用酶提供了新思路，具有良好的工业应用前景。
附图说明
[0020]图1为嵌合体电泳图，泳道M：蛋白Marker；泳道1：嵌合体160。
[0021]图2为酶的催化表征图。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体详细描述，但本专利技术的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。嵌合体160氨基酸序列如下(SEQ NO.1)：
[0023]MTETYPVVKGAEPFFFEGNDIGILVLHGFTGSPQSMRPLGEAYHEAGYTVCGPRLKGHGTHYEDMEKTTCQDWIDSVEAGYEWLKNRCGTIFVTGLSMGGTLTLYMAEHHPEICGIAPINAAINMPALAGALAGVGDLPRFLDAIGSDIKKPGVKELAYEKTPVKSIGEITELMKKVKGDLEKVNCPALIFVSKEDHVVPPSNSQEIYSSIKSAAKELVTLDNSYHVATLDNDQDIIIERTLHFLQRVLETSSLQG
[0024]脂肪酶嵌合体的基因的核苷酸序列如下(SEQ NO.2)：
[0025]ATGACCGAAACCTACCCGGTTGTTAAAGGCGCCGAACCGTTCTTCTTCGAAGGCAACGATATCGGTATC
CTGGTTCTGCACGGCTTCACCGGTAGCCCGCAGAGCATGCGTCCGCTGGGTGAAGCATACCACGAAGCGGGTTAC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋微生物脂肪酶嵌合体，其特征在于，所述脂肪酶嵌合体氨基酸序列如SEQ NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的脂肪酶嵌合体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因核苷酸序列如SEQ NO.2所示。4.含有权利要求3所述的基因的重组质粒。5.含有权利要求4所述的重组菌。6.一种构建权利要求1所述海洋微生物脂肪酶嵌合体的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝东明，李爽，王永华，杨博，王方华，刘萱，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：