一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种类鼻疽菌多糖，含有聚合交联的五糖重复单元[3

【技术实现步骤摘要】
一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程和生物医药
，特别涉及一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，BP)简称类鼻疽菌，属兼性胞内革兰氏阴性菌，可存在于水源、土壤中，主要引起一种以肝、肺等脏器多发性脓肿为特点的类鼻疽疾病。该病主要分布在东南亚和澳大利亚北部，我国的海南、广东、台湾、香港等沿海城市和地区逐渐成为流行区。人和动物可通过皮肤擦伤、吸入或摄入等方式感染该菌，其临床表现多样，包括无症状感染、亚临床感染、重症败血症等，死亡率达40％左右，且复发率也较高(5％
‑
28％)，并且由于其具有易传播、致病强，耐药广、无疫苗等特点，被WHO列为B类生物恐怖剂。
[0003]类鼻疽菌能够表达多种毒力因子，除III型分泌系统(typeIIIsecretion system，T3SS)、
Ⅵ
型分泌系统(type
Ⅵ
secretion system，T6SS)和VirAG双组分调节系统外，其表面还存在丰富的多糖成分，如脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、荚膜多糖(capsular polysaccharides，CPS)和胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)等也被证实是重要的毒力因子和保护性抗原，在类鼻疽菌致病以及免疫调节过程中发挥着重要的作用。现有技术文献的报道，是来自美国或泰国的类鼻疽临床分离株可表达多种不同的LPS抗原和CPS抗原，但截至目前，我国尚无关于类鼻疽菌临床分离株表面多糖的相关报道，对其多糖抗原类型及其生物学功能尚不清楚，因此，当前我国亟需建立分离类鼻疽菌表面多糖的方法，以促进进一步的研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种类鼻疽菌多糖的提取、纯化方法，并获得了类鼻疽临床菌株的多糖，利用多种化学分析法和仪器分析法对其结构进行了表征，并对其免疫学性质进行了初步研究。本专利技术，同时还鉴定出一种由五糖重复单元构成的多糖抗原可作为类鼻疽的血清学诊断和候选疫苗抗原方面的应用。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先基于类鼻疽菌的国内标准株提取纯化提供了一种分子量分布均一、结构新颖的类鼻疽菌多糖，其含有聚合交联的五糖重复单元[3
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(a
‑
D
‑
Manp
‑1→3‑
a
‑
D
‑
Manp)4‑
2Me
‑
a
‑
L
‑
6dTalp
‑1→
]。
[0006]经纯化鉴定后，确定该胞外多糖的结构式为：
[0007][3
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(a
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D
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Manp
‑1→3‑
a
‑
D
‑
Manp)4‑
2Me
‑
a
‑
L
‑
6dTalp
‑1→
]n
，n＝100～700。
[0008]本专利技术进一步提供了类鼻疽菌多糖的制备方法，包括：
[0009]1)制备类鼻疽菌粗多糖，将所述类鼻疽菌粗多糖复溶于一级水中，获得粗多糖重溶液，然后将所述粗多糖重溶液通过离子交换层析柱线性梯度洗脱纯化，基于洗脱峰收集多糖洗脱液，再将所收集的多糖洗脱液经透析和冻干获得第一次纯化的多糖产物；
[0010]2)将所述第一次纯化的多糖产物复溶于一级水中，获得溶液，将所述第一次纯化的多糖产物溶液经分子筛层析进行纯化，基于洗脱峰收集对应的洗脱液，获得单组分多糖洗脱液，再将所述单组分多糖洗脱液透析和冻干，即得纯化的类鼻疽菌多糖。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤1)中，所述离子交换层析柱线性梯度洗脱是利用0～1.5M NaCl溶液进行线性梯度洗脱；
[0012]优选地，所述离子交换层析柱选自DEAE Sepharose Fast Flow或DEAE Cellulose或Q
‑
Sepharose Fast Flow；
[0013]优选地，粗多糖重溶液浓度为5mg/mL～10mg/mL；
[0014]优选地，洗脱时使用的洗脱曲线是根据苯酚硫酸法绘制得到的。
[0015]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)中，洗脱是通过以0.15M NaCl溶液为洗脱液，以0.15mL/min的流速的方法实现的；
[0016]优选地，所述第一次纯化的多糖产物溶液浓度为10mg/mL～20mg/mL；
[0017]优选地，所述分子筛层析选自Sepharose Cl
‑
6B或Sephacryl S
‑
400HR。
[0018]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述类鼻菌粗多糖是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
[0019]a)将类鼻疽菌的灭活菌体以PBS缓冲液重悬，于37℃磁力搅拌1h，离心，取上清液，获得粗提液；优选地，将沉淀物再次以PBS缓冲液重悬，于37℃磁力搅拌1h，离心后，取重提上清液，并将重提上清液与初提上清液合并；所述类鼻疽菌为BPC006、BPC010、BPC018、BPC084、BPC158中的任一种；
[0020]b)向粗提液中加入核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和蛋白溶解酶，以酶解粗提液中的核糖核酸、脱氧核糖核酸和蛋白质成分，将酶解后的粗提液加热至变性温度终止酶解，离心后取上清获得酶解液；
[0021]c)将所述酶解液转移至透析袋中进行透析处理后，经浓缩后冻干即得粗多糖。
[0022]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤b)中所述脱氧核糖核酸酶为脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)；所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A(RNaseA)；所述蛋白溶解酶为蛋白酶K(ProteinaseK)；
[0023]优选地，所述酶解是通过包括下述步骤的方法实现的：
[0024]先向粗提液中加入DNaseI和RNaseA，于37℃磁力搅拌2h，然后加入ProteinaseK，于60℃磁力搅拌3h，最后在80℃处理30min终止酶解；更优选地，核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶在酶解液中的终浓度分别为50μg/mL。
[0025]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤a)中所述类鼻疽菌的灭活菌体是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
[0026]将培养类鼻疽菌的菌液以8000rpm离心5min，弃上清，向菌体沉淀中加入PBS缓冲液重悬菌体，重悬菌液再次离心，弃上清，最后向菌体沉淀中加入PBS缓冲液，充分混匀后于70℃以上温度下水浴处理至少30min，使菌体灭活。
[0027]本专利技术还提供了上述类鼻菌多糖在制备用于诊断、预防或治疗类鼻疽菌感染的制剂中的应用。
[0028]本专利技术进一步提供了用于预防或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类鼻疽菌多糖，其特征在于，含有聚合交联的五糖重复单元[3
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(a
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D
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Manp
‑1→3‑
a
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D
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Manp)4‑
2Me
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a
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L
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6dTalp
‑1→
]。2.如权利要求1所述的类鼻疽菌多糖，其特征在于，结构式为：[3
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(a
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D
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Manp
‑1→3‑
a
‑
D
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Manp)4‑
2Me
‑
a
‑
L
‑
6dTalp
‑1→
]
n
，n＝100～700。3.如权利要求1或2所述的类鼻疽菌多糖的制备方法，其特征在于，包括：1)制备类鼻疽菌粗多糖，将所述类鼻疽菌粗多糖复溶于一级水中，获得粗多糖重溶液，然后将所述粗多糖重溶液通过离子交换层析柱线性梯度洗脱纯化，基于洗脱峰获收集多糖洗脱液，再将所收集多糖洗脱液经透析和冻干获得第一次纯化的多糖产物；2)将所述第一次纯化的多糖产物复溶于一级水中，获得溶液，将所述第一次纯化的多糖产物溶液经分子筛层析进行第二次纯化，基于洗脱峰收集对应的洗脱液，获得单组分多糖洗脱液，再将所述单组分多糖洗脱液透析和冻干，即得纯化后的类鼻疽菌多糖。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述离子交换层析柱线性梯度洗脱是利用0～1.5M NaCl溶液进行线性梯度洗脱；优选地，所述离子交换层析柱选自DEAE Sepharose Fast Flow或DEAE Cellulose或Q
‑
Sepharose Fast Flow；优选地，粗多糖重溶液浓度为5mg/mL～10mg/mL；优选地，洗脱时使用的洗脱曲线是根据苯酚硫酸法绘制得到的。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，洗脱是通过以0...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫晶敏，章美娟，李倩，李骁，饶承龙，杨文波，毛旭虎，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：