EPCAM抗体和EPCAM-CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术涉及人源化单克隆抗人EpCAM抗体，例如单链可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸的V

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】EPCAM抗体和EPCAM
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CAR
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T细胞
[0001]序列表、表格或计算机程序的引用
[0002]序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS
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Web与说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2020年1月22日，并且大小为18.5千字节。通过EFS
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Web提交的序列表是说明书的一部分，并在此通过引用全文并入本文。


[0003]本专利技术涉及人源化EpCAM抗体和EpCAM
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CAR
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T细胞，其可用于肿瘤的过继性免疫基因治疗领域。

技术介绍

[0004]免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)构建体对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的最常见方法。可以将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR
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T细胞注入到患者体内(称为过继性细胞转移或ACT)，其代表一种有效的免疫治疗方法[1，2]。与化学疗法或抗体相比，CAR
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T技术的优点在于，重编程改造的T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“一种活的药物”)[1，2]。
[0005]CAR通常由以下组成：在N末端部分的单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域、以及与激活CD3
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ζ结构域串联的若干个胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4
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1BB)、CD27或其它共刺激结构域。(图1)[3]。CAR的演变从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)再到第三代CAR(具有若干个共刺激结构域)。生成具有多重共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)使得CAR
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T细胞杀伤活性增加，并改善了CAR
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T细胞持久性，从而增强了其抗肿瘤活性。
[0006]图1显示了CAR的结构。左图显示了第一代CAR(无共刺激结构域)的结构。中图显示了第二代CAR(一个共刺激结构域)的结构。右图显示了第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)[3]。
[0007]EpCAM
[0008]EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule(上皮细胞粘附分子))(CD326)抗原是一种39
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40kDa的细胞表面糖蛋白，其由EpCAM基因编码。EpCAM在细胞粘附、生长、增殖、炎症、癌症和转移中起关键作用。它在多种类型的肿瘤中是高度过表达的：在乳腺癌中35.6％；在卵巢癌中69％；在非小肺癌中86％；在结肠直肠癌中>86％。EpCAM在许多正常组织中均有表达，但在肿瘤组织中的表达显著更高。最近用siRNA、单克隆抗EpCAM抗体、双特异性抗体和CAR
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T细胞证实了靶向EpCAM。
[0009]人EpCAM蛋白由314个氨基酸组成：24
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265，胞外结构域；266
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288，跨膜结构域；289
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314，细胞质结构域。EpCAM涉及WNT、ERK、AKT存活信号传导，并且在运动、增殖和细胞生长中起作用。EpCAM也是循环肿瘤细胞和癌症干细胞的标志物。
附图说明
[0010]图1显示了CAR的结构。左图显示了第一代CAR(无共刺激结构域)的结构。中图显示了第二代CAR(一个共刺激结构域)的结构。右图显示了第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)[3]。
[0011]图2显示了EpCAM CAR构建体的结构。使用第二代CAR。
[0012]图3显示了25.4％的人源化EpCAM
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CAR
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T细胞(CD28共刺激，实施例2，PMC 306)对抗人F(ab)2呈阳性，而23％的人源化EpCAM
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CAR
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T细胞对抗小鼠F(ab)2呈阳性。
[0013]图4显示了35.2％的人源化EpCAM
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CAR
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T细胞(4
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1BB共刺激，实施例3，PMC 710)对抗小鼠F(ab)2呈阳性。
[0014]图5显示了小鼠EpCAM
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CAR
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T细胞具有EpCAM的低表达，并且仅2.23％的小鼠EpCAM
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CAR
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T细胞通过抗小鼠F(ab)2检测到。
[0015]图6A证实了人源化EpCAM
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CAR细胞对结肠直肠癌(HT29细胞)的高细胞毒性。
[0016]图6B证实了人源化EpCAM
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CAR细胞对结肠癌(Lovo细胞)的细胞毒性。
[0017]图6C证实了人源化EpCAM
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CAR细胞对卵巢癌(OVCAR
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3细胞)的高细胞毒性。
[0018]图6D证实了人源化EpCAM
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CAR细胞对宫颈癌(Hela细胞)的细胞毒性。
[0019]图6E证实了人源化EpCAM
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CAR细胞对乳腺癌(SKBR
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3细胞)的细胞毒性。
[0020]图7比较了人源化EpCAM
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CAR
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T细胞(PMC376)和小鼠EpCAM
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CAR
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T细胞在Lovo靶细胞中的细胞毒性。
[0021]图8显示了人源化EpCAM
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CAR(PMC376)针对HT29、Lovo
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1、OVCAR
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3和SKBR3细胞分泌高水平的IFN
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γ。完成了三次独立的实验。
[0022]图9A
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9B显示了人源化EpCAM
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CAR
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T细胞(PMC376)显著降低了Lovo
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1肿瘤体积(9A)和肿瘤重量(9B)。p<0.05：在图9A和9B中均为EpCAM
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CAR
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T细胞(新鲜和冷冻的)相对于PBS和T细胞。
[0023]图10显示了用人源化EpCAM
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CAR
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T细胞治疗的小鼠并未降低体重。
具体实施方式
[0024]定义
[0025]如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种受体蛋白，其已进行改造以给予T细胞靶向特异性蛋白的新能力。该受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能组合到单个受体内。CAR是一种融合蛋白，其包含能够与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种人源化抗人EpCAM抗体，包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸的V
H
和具有SEQ ID NO:4的氨基酸的V
L
。2.一种单链可变片段(scFv)，包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸的V
H
和具有SEQ ID NO:4的氨基酸的V
L
。3.根据权利要求2所述的scFv，其进一步包括位于V
H
和V
L
之间的接头。4.根据权利要求2所述的scFv，其具有SEQ ID NO:5的氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，维塔，
申请(专利权)人：湖南远泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：