用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂制造技术

本发明专利技术公开了用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂，属于酶制剂领域。本发明专利技术提供的蛋白酶K液体酶制剂中，蛋白酶K的浓度10mg/ml≤C≤60mg/ml，缓冲液浓度为10mM

【技术实现步骤摘要】
用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂


[0001]本专利技术涉及用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂，具体涉及到一种在常温存储和性状稳定的蛋白酶K(EC 3.4.21.64)液体制剂及制备方法，属于酶制剂领域。

技术介绍

[0002]蛋白酶K(PRK，EC 3.4.21.64)属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)产生的一类主要蛋白酶。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水氨基酸、含硫芳香族C末端邻接的酯键和肽，常被用于降解蛋白生产短肽。蛋白酶K能将蛋白失活或降解，这个特性使得蛋白酶K在核酸纯化、丝绸、医药食品和酿造等领域都有着重要的应用。例如，在生化实验中，提取核酸时，可以利用蛋白酶K除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位杂交实验中，可以利用蛋白酶K降解包围靶DNA的蛋白质，以及处理杂交前的样本以提高检测的敏感性；此外蛋白酶K还可以用于制备IVD生化检测试剂和分子诊断试剂。
[0003]蛋白酶K活性的活性主要受一些蛋白酶抑制剂和酶活性中心的Ca
2+
影响。加入螯合剂EDTA后，蛋白酶K催化活性将在6h内丧失80％左右，这可能是由于Ca
2+
的丢失会引起活性中心远端蛋白构象的变化，若再加入Ca
2+
则其活性又会恢复至28％左右。除Ca
2+
离子会影响外，蛋白酶K的酶活还会被DFP、PMSF等抑制，但是却不会被胰蛋白类丝氨酸蛋白酶抑制剂(TLCK)、糜蛋白类丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tos
‑
Lys
‑
CH2Cl)或巯基试剂等抑制。
[0004]源自林伯氏白色念球菌的蛋白酶K的比活力是所知的肽链内切酶中最高的，在没有Ca
2+
的条件下蛋白酶K的剩余活性通常就足以满足降解蛋白质的应用要求，例如，在纯化核酸时，通常需加入EDTA螯合Mg
2+
以消除核酸酶的降解作用，在这个过程中，EDTA会同时螯合Ca
2+
，使得蛋白酶K处于无Ca
2+
的环境，但失去Ca
2+
的蛋白酶K活性仍可满足降解蛋白质的要求。但在消化如角蛋白一类对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白时，则需要在反应液中添加1mM Ca
2+
。除此之外，蛋白酶K在0.5％SDS和1％(w/v)Triton X
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100中也能较好地保持活力。
[0005]酶制剂是指酶经过提纯、加工后的具有催化功能的生物制品，主要用于催化生产过程中的各种化学反应，具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点，其应用领域遍布食品(面包烘烤业、面粉深加工、果品加工业等)、纺织、饲料、洗剂剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等方面。酶制剂来源于生物，一般地说较为安全，可按生产需要适量使用。酶制剂可以由细菌或真菌等产酶微生物来生产，大部分采用基因重组表达，也有部分采用原始菌提取的方法来获得。固体剂型的酶制剂最大的优点是易于保存，在存放过程中酶的稳定性比较好。固体剂型的最大弊病是针对发酵得到的酶需要或萃取或盐析提取或喷雾提取，都会消耗非常多的能源。液体酶制剂可以避开固体酶制剂的上述缺陷，但同时也存在两个主要的问题，一是产品存放过程不能变质沉积，而是在水分多的液体环境中酶不稳定容易变质丧失活性。因此，作为液体酶制剂，需要将生产和销售衔接得很好、贮存期不能太长。
[0006]现有的大部分酶制剂在工业上都是以酶粉形态或者全细胞的形态应用于催化合
成行业中，催化合成行业对蛋白纯度要求很低或没有要求，而生化和分子用酶对蛋白纯度要求则很高。无论是粉末状态或液体状态都需要具备较好的稳定性，通常会使用一些糖类、醇类、金属离子、EDTA、乙酸钠、丁酸钠或柠檬酸钠，或一些蛋白类物质保护剂来提升酶制剂的稳定性。
[0007]市面上目前提供的蛋白酶K主要有两种制剂类型，酶粉和液体酶两种，主要以酶粉为主导产品。包括全球性的蛋白酶K生产商罗氏、默克在内厂家提供的产品，无论是酶粉或是液体制剂，均是储存在2
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8℃；而国内近年来兴起的大部分PRK生产厂家的提供的酶粉储存温度是
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20℃，液体制剂为2
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8℃。在蛋白酶K的生产过程中，液体状态的产品省去了产品冻干这一会损失产品活力的关键步骤，液体制剂的蛋白酶K能够更好地保持原始状态下的酶活力。且，粉末制剂的产品在使用过程中漂浮在空气中影响实验室环境，存在较大的污染风险。目前，随着蛋白酶被用于提取各组织中的DNA成分而加入消化反应体系，越来越多的公司更青睐于使用液体制剂的蛋白酶K，同时，液体状态的蛋白酶K还有简化使用过程的优点。但是，2
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8℃储存的液体蛋白酶K制剂在运输方面，尤其是进出口运输、向热带国家运输的过程，需要额外增加运输和储存成本来保证产品性质，并且，即使增加控温成本在高温下也还是很难保证蛋白酶K性质不受影响。
[0008]目前，液体酶制剂使用最为广泛的主要是用于进行分子生物学操作的分子酶产品，成分主要是一些buffer、表面活性剂和保护剂类型，但是也需要于
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20℃或2
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8℃保存，且也存在着不可反复冻融的情况。CN 108431219 A提供了α
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淀粉酶的液体制剂配制方法，配制出来的α
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淀粉酶液体制剂可以在25℃下具有至少1年的保存期限，其中配方包括酶、缓冲剂、保护剂和防腐剂，极好地匹配了α
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淀粉酶的应用。CN 107326019A公开了一种液体酶制剂及制备方法，主要解决了谷氨酰胺转氨酶液体制剂在常温下难保存的技术问题，通过配方研发实现了酶制剂常温下保持6个月酶活80％以上、性状稳定、无微生物腐败、使用效果良好。其余一些已实现商业化的液体酶，如液体脂肪酶(CN 103525797A)，果胶酶(CN 104531653A)等已实现了保存运输过程中的便利性。但，目前在全球范围内还未有商业化的在常温条件下可稳定储存运输的液体蛋白酶K制剂的相关报道，且已报道的液体酶制剂也大部分都是工业化酶方面的应用较多，同时蛋白纯度也有限，无法直接套用蛋白酶K的液体制剂配制；而分子酶相关的液体制剂报道主要都是一些嗜热微生物方面的液体制剂，酶的稳定性极佳，不太需要考虑到酶的室温或
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20℃储存稳定性，无法为蛋白酶K液体制剂的制备提供参考。
[0009]为此，为了解决用途广泛的蛋白酶K的更大规模化生产和常温储存运输问题，需要在降低生产成本、做好安全防护、包装问题以及迎合酶制剂未来的发展趋势，实现常温状态下蛋白酶K液体制剂的工业化生产显得极为迫切和意义重大。

技术实现思路

[0010][技术问题][0011]本专利技术要解决的技术问题是，蛋白酶K的液体制剂在常温储存运输、反复冻融时会出现活力损失本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶K液体酶制剂，其特征在于，主要包括蛋白酶K、缓冲液、Ca
2+
、保护剂、防腐剂，或者还含有其他不影响蛋白酶K性质和应用的成分；其中，蛋白酶K的浓度10mg/ml≤C≤60mg/ml，缓冲液浓度为10mM
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200mM，Ca
2+
浓度为0.01
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10mM，固体形式的保护剂的添加量是蛋白质量的1％
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200％，液体形式的保护剂的添加量是酶液体积的10％
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200％，防腐剂的总添加量是0.01％
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0.5％。2.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂，其特征在于，所述蛋白酶K是来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)的蛋白酶K，通过基因工程手段表达得到或者从野生菌中分离提取得到。3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂，其特征在于，所述蛋白酶K无杂酶和微生物污染，所述微生物包括常见细菌和真菌类微生物。4.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂，其特征在于，所述缓冲液包括但不限于乙酸
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乙酸钠、Tris
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HCl、甘氨酸
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NaOH缓冲液，其中pH 5.0
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pH 7.0为乙酸
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乙酸钠缓冲液，pH 7
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗漫杰，宫安，施婧妮，徐灿，王梁，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：