一种纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种纤维蛋白溶解酶，其特征在于，所述的纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的纤维蛋白溶解酶的核苷酸编码序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术提供的纤维蛋白溶解酶制备方法简单，获得的酶活较高，体外溶栓率可达80%以上，体内溶栓能力也超出常用药物尿激酶和链激酶，同时也具有很好的体外抗凝效果，具有很好的临床应用前景。具有很好的临床应用前景。具有很好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于蛋白酶制剂领域，具体涉及一种纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，血管内血栓形成是心脑血管疾病发病的一个主要原因。在可变的流体依赖型(variable flow dependent patterns)中，血栓由不溶性纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。心血管内膜损伤、血流改变、血液性质改变都有可能造成血栓的形成。
[0003]目前针对血栓的治疗主要依靠抗血栓药，抗血栓药可分为抗凝血药、抗血小板聚集药和溶血栓药三大类，其中溶血栓药物可用于治疗急性血栓栓塞性疾病。第一代的溶栓药链激酶(SK）和尿激酶(UK）至今仍然是国内外使用最广泛的品种，其溶栓原理为凝血中形成的纤维蛋白，经纤维蛋白溶解酶作用从精氨酸
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赖氨酸键上分解成可溶性产物，使血栓溶解。纤维蛋白溶解酶的研究对于开发新的溶栓药物十分必要。
[0004]中国专利200510094753.4中公开了一种纤维蛋白溶解酶生产菌及生产纤维蛋白溶解酶的方法。该专利技术从发酵食品虾酱中筛选出一种能生产具有溶血栓能力酶的菌株并提供了用该菌株生产纤维蛋白溶解酶的方法，其育种工作量小，费用低，安全性能可靠，可以进行液体发酵生产，成本低，可用于大规模生产。发酵产品无毒，可以直接制成胶囊、冲剂、口服液或口服含片，或作为功能性食品配料用于保健食品或普通食品中。其酶活可达588.4U/mL以上，有进一步优化的空间。
[0005]中国专利201110054330.5中公开了一种编码纤维蛋白溶解酶的cDNA序列和氨基酸序列及其应用。该专利技术以单环刺螠总RNA为模板，克隆得到了单环刺螠纤维蛋白溶解酶基因全长cDNA序列。由该纤维蛋白溶解酶基因的cDNA原始编码序列，翻译得到单环刺螠纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列。单环刺螠纤维蛋白溶解酶基因的cDNA序列，可以通过构建不同的重组质粒载体，构建如大肠杆菌或酵母菌等不同受体的纤维蛋白溶解酶基因工程菌，使之在基因工程菌中进行表达，从而制备纤维蛋白溶解酶。制备的纤维蛋白溶解酶可应用于制备治疗心脑血管疾病的抗凝血药物或溶解血栓药物，具有很好的研究开发前景。但其体内作用效果不明确，且分离纯化方法较为复杂。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种纤维蛋白溶解酶。本专利技术提供的纤维蛋白酶制备方法简单，得到的纤维蛋白酶酶活性高，且在体内和体外均有较好的溶栓效果，并有很好的体外抗凝效果。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种纤维蛋白溶解酶。
[0008]所述的纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0009]所述的纤维蛋白溶解酶的核苷酸编码序列为SEQ ID NO.2。
[0010]所述的纤维蛋白溶解酶包括前导肽和成熟肽两部分。
[0011]所述的前导肽部分为SEQ ID NO.5。
[0012]另一方面，本专利技术提供了一种纤维蛋白溶解酶的制备方法。
[0013]所述的制备方法包括以下步骤：（1）根据SEQ ID NO.2的序列进行包含前导肽和成熟肽部分扩增引物的设计并合成引物；（2）提取蛹虫草RNA并进行反转录获得cDNA；（3）以步骤（2）cDNA为模板，使用步骤（1）得到的引物进行扩增；（4）将步骤（3）得到的扩增产物插入表达载体后转染细胞；（5）对步骤（4）获得的细胞进行培养，培养物分离纯化后即可获得纤维蛋白溶解酶。
[0014]优选地，所述的步骤（1）中的引物序列包括正向引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4。
[0015]所述的步骤（5）中的分离纯化包括以下步骤：A、培养得到的细胞超声破碎提取机进行破壁，离心取上清，4℃，10000rpm离心20min；B、镍柱亲和层析纯化得到纤维蛋白溶解酶：上样预先平衡好的Ni
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NTA（5mL）柱，流速5mL/min；C、上样结束继续冲洗20个柱体积，之后利用洗脱缓冲液线性洗脱10个柱体积；利用自动收集器进行收集，根据出峰位置进行酶活检测及电泳检测。
[0016]所述的步骤（4）中的表达载体包括原核表达载体或真核表达载体；所述的原核表达载体包括但不限于pEASY
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Blunt E2、pET
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5a(+)；所述的真核表达载体包括但不限于pVAX1、pYES3。
[0017]所述的步骤（4）中的转染用细胞包括但不限于大肠杆菌BL21（DE3）、DH5α、HEK293或293T。
[0018]再一方面，本专利技术提供了一种生物学载体。
[0019]所述的生物学载体可以是表达载体，所述的表达载体中包括前述的核苷酸编码序列。
[0020]所述的生物学载体还可以是细胞，所述的细胞中包括前述表达载体。
[0021]又一方面，本专利技术提供了前述的纤维蛋白溶解酶和/或前述的核苷酸编码序列和/或前述的制备方法和/或前述的生物学载体在制备溶栓药物和/或抗凝药物中的应用。
[0022]所述的药物包括但不限于注射液，口服药物。
[0023]所述的注射液中纤维蛋白溶解酶的含量为0.15mg/mL
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0.45mg/mL。
[0024]所述的纤维蛋白酶作为药物的成分在施用时的用量为0
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3mg/kg体重。
[0025]又一方面，本专利技术提供了一种溶栓药物。
[0026]所述的溶栓药物中包括前述的纤维蛋白溶解酶和/或前述的生物学载体。
[0027]所述的溶栓药物包括但不限于注射液，口服药物。
[0028]所述的注射液中纤维蛋白溶解酶的含量为0.15mg/mL
‑
0.45mg/mL。
[0029]所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体。
[0030]又一方面，本专利技术提供了一种抗凝药物。
[0031]所述的抗凝药物中包括前述的纤维蛋白溶解酶和/或前述的生物学载体。
[0032]所述的抗凝药物包括但不限于注射液，口服药物。
[0033]注射液中纤维蛋白溶解酶的含量为0.15mg/mL
‑
0.45mg/mL。
[0034]所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体。
[0035]本专利技术的有益效果：1、本专利技术提供的纤维蛋白溶解酶体外和体内的溶栓率更高，溶栓效果更好。中国专利201910170774 .1提供的一种纤维蛋白溶解酶体外溶栓效果在24h后为40%以上，体内溶栓效果单位酶活溶栓率83
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289 U/cm；中国专利201110054330.5提供的一种纤维蛋白溶解酶体外3h溶栓率76.4%；本申请提供的纤维蛋白溶解酶体外3h溶栓率在80%以上，体内溶栓效果单位酶活溶栓率62
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135.6 U/cm。
[0036]2、本专利技术提供的纤维蛋白酶制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纤维蛋白溶解酶，其特征在于，所述的纤维蛋白溶解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的纤维蛋白溶解酶包括前导肽和成熟肽两部分。2.根据权利要求1所述的纤维蛋白溶解酶，其特征在于，所述的纤维蛋白溶解酶的核苷酸编码序列为SEQ ID NO.2。3.一种纤维蛋白溶解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据SEQ ID NO.2的序列进行包含前导肽和成熟肽部分扩增引物设计并合成引物；（2）提取蛹虫草RNA并进行反转录获得cDNA；（3）以步骤（2）cDNA为模板，使用步骤（1）得到的引物进行扩增；（4）将步骤（3）得到的扩增产物插入表达载体后转染细胞；（5）对步骤（4）获得的细胞进行培养，培养物分离纯化后即可获得纤维蛋白溶解酶。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（5）中的分离纯化包括以下步骤：A、培养得到的细胞超声破碎提取机进行破壁，离心取上清，4℃，10000rpm离心20min；B、镍柱亲和层析纯化得到纤维蛋白溶解酶：上样预先平衡好的Ni
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NTA（5mL）柱，流速5mL/min；C、上样结束继续冲洗20个柱体积，之后利用洗脱缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘英丽，王静，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：