一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于等温扩增

【技术实现步骤摘要】
一种基于等温扩增
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CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于寄生虫检测
，具体涉及一种基于等温扩增
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CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]刚地弓形虫(Toxoplasma gondii Nicolle&Manceaux,1908)是由法国学者Nicolle和Manceaux在突尼斯刚地梳趾鼠的肝脾单核细胞中发现，因其滋养体呈弓形，故简称为弓形虫或弓形体。该虫是一种专性细胞内寄生性原虫，可感染全世界约三分之一的人群及几乎所有的温血动物。猫科动物通常在感染弓形虫后会排泄大量的卵囊，这些卵囊会伴随粪便进入环境并在一定条件下发展成为感染性的孢子化卵囊，从而在环境中造成水源、土壤、瓜果和蔬菜等的污染。人或动物有可能在活动过程中接触被弓形虫卵囊污染的土壤或摄取被卵囊污染的食物或水源而感染。健康的人感染弓形虫后通常处于阴性感染状态，而免疫缺陷的患者感染后，会不同程度地损伤大脑、心脏、眼底等部位，甚至危及生命。此外，孕妇如果受到感染，会通过胎盘经垂直传播给胎儿，导致流产、死胎和畸胎，甚至胎儿会在生长过程中表现出精神疾病以及运动障碍等。
[0003]目前弓形虫的实验室诊断方法主要有显微检测、免疫学以及分子生物学三种方法。显微检测技术是一种传统的检测寄生虫的方法。但该方法主要依靠人肉眼识别，因此不仅工作量大而且受工作人员的经验及专业程度影响较大。免疫学诊断方法是诊断弓形虫的重要方法之一，其中包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝试验(IHA)、间接荧光免疫试验(IFA)、染色试验(DT)等。虽然这些诊断方法具有特异性高和操作简便优点，但同时也存在一些缺点例如敏感性不高以及不能对早期感染进行及时检测。
[0004]近年来随着分子生物学的不断发展，分子生物学检测技术也随之应用于弓形虫的分子检测中，例如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、套式PCR等，它们都具有特异性强、灵敏度高等优点。但是，大部分情况下PCR都需要专业的仪器设备和相关技术人员，因此限制了其推广。此外，这些分子检测技术还存在一些弊端，比如成本较高、耗时耗力、操作复杂等。虽然现有技术还开发了新型的检测手段，例如基于CRISPR的检测技术，但是对弓形虫检测而言缺乏特异性强的检测靶点。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于特异性检测弓形虫的crRNA，具有较强弓形虫核酸结合特异性。
[0006]本专利技术的目的还在于提供一种基于等温扩增
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CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用，具有操作简便，快速，且检测灵敏高的特点。
[0007]本专利技术提供了一种用于特异性检测弓形虫的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术提供了一种基于等温扩增
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CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒，包括以下组分：
[0009]所述crRNA、Cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssDNA。
[0010]本专利技术提供了所述crRNA或所述试剂盒在检测环境中弓形虫中的应用。
[0011]优选的，所述环境包括环境土壤以及水源。
[0012]优选的，所述弓形虫DNA包括弓形虫卵囊DNA。
[0013]本专利技术提供了基于所述试剂盒检测环境中弓形虫的方法，包括以下步骤：
[0014]1)提取环境样品中总DNA；
[0015]2)以步骤1)提取的总DNA为模板进行等温扩增，得到扩增产物；
[0016]3)将crRNA和Cas12a蛋白混合，孵育，得到核酸蛋白复合物；
[0017]4)将所述核酸蛋白复合物与所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液混合，孵育，得到反应产物；
[0018]5)将所述反应产物测定荧光强度，根据荧光强度的有无判断环境样本中是否含有弓形虫：当检测到荧光强度信号时，表明环境样本中含有弓形虫，反之则不含。
[0019]优选的，步骤3)中crRNA和Cas12a蛋白的摩尔比为1:0.8。
[0020]优选的，步骤4)中所述核酸蛋白复合物、所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液的体积比为1:1:1；
[0021]所述荧光报告基团标记的ssDNA溶液的浓度为1μM。
[0022]优选的，步骤2)中所述等温扩增包括重组酶介导扩增、环介导等温扩增、依赖核酸序列扩增或重组酶聚合酶扩增。
[0023]优选的，所述环境样本中弓形虫的浓度不低于100copies/μL。
[0024]本专利技术提供的用于特异性检测弓形虫的crRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述crRNA仅与弓形虫核酸特异性结合，而与新孢子虫、隐孢子虫、微孢子虫、芽囊原虫、艾美耳球虫、犬弓手蛔虫无交叉反应，表明crRNA具有较高的特异性，为准确鉴定弓形虫奠定了基础。
[0025]本专利技术还提供了一种基于等温扩增
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CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒，Cas12a在通过crRNA识别靶标序列(ssDNA或者dsDNA)后被激活，激活后的Cas12a除了靶向切割靶标序列外，还具有“附带”切割能力，能够切割任意单链DNA序列。基于Cas12a的这一特性，人们通过设计靶向病原微生物部分基因序列的crRNA，以FQ
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ssDNA序列来指示检测样品中是否含有靶标序列。若不含靶标序列，在490nm激光照射下溶液不会发出荧光；若存在靶标序列，则会发出荧光。基于RAA
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CRISPR/Cas12a技术可在较低温度(体温)下对弓形虫的核酸进行检测，整个过程只需1个小时左右，并且只需要一台便携式荧光检测仪即可或用肉眼直接在紫外灯光下进行观察。与传统的PCR方法相比，大大缩短了时间，基于以上特点，该技术特别适合于基层单位和现场检测。同时Cas12a的附属切割活性也起到了信号放大作用,所以RAA
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CRISPR/Cas12a技术对弓形虫的检测敏感性非常高，达到了100copies/μL。此外，crRNA引导的Cas蛋白激活过程是一种序列特异性的识别过程,所以非特异性扩增产物不会激活Cas蛋白的活性，这就决定了该试剂盒的检测特异性，与新孢子虫、隐孢子虫、微孢子虫、芽囊原虫、艾美耳球虫、犬弓手蛔虫无交叉反应。
附图说明
[0026]图1为RAA
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CRISPR/Cas12a技术检测环境土壤样品的结果，其中横坐标表示发射波长；纵坐标表示荧光强度；Positive sample表示诊断的样品为阳性，Negative sample表示诊断样品为阴性；
[0027]图2为本专利技术实施例中基于RAA
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CRISPR/Cas12a技术的检测试剂盒的特异性评估结果；其中横坐标表示发射波长；纵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于特异性检测弓形虫DNA的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种基于等温扩增
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CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫DNA的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：权利要求1所述crRNA、Cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssDNA。3.权利要求1所述crRNA或权利要求2所述试剂盒在检测环境中弓形虫DNA中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述环境包括环境土壤、水源。5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述弓形虫DNA包括弓形虫卵囊DNA。6.一种基于权利要求2所述试剂盒检测环境中弓形虫DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取环境样品中总DNA；2)以步骤1)提取的总DNA为模板进行等温扩增，得到扩增产物；3)将crRNA和Cas12a蛋白混合，孵育，得到核酸蛋白复合...

【专利技术属性】
技术研发人员：王萌，马巧妮，朱兴全，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：