一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。此外，本发明专利技术还公开了包含了上述引物探针组合物的试剂盒及该引物探针组合物的应用。本发明专利技术能够快速、有效地检测环孢子虫，检测准确性、特异性和敏感性高，所述的检测试剂盒灵敏、稳定、有效。有效。有效。

【技术实现步骤摘要】
一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及寄生虫的分子生物学检测
，特别是涉及一种用于定性检测环孢子虫DNA的引物组、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]环孢子虫(Cyclospora，又称圆孢子虫)是一种人畜共患的肠道致病性原虫，在免疫功能正常或免疫受损的个体中均可导致严重腹泻及其他胃肠道疾病，同时还伴随有食欲减退、乏力、腹胀、腹痛、恶心、呕吐、体质量减轻等症状，严重的甚至导致死亡。环孢子虫生活史属于典型的单宿主型，即在一个宿主体内完成无性繁殖和有性繁殖。宿主刚排出粪便中的环孢子虫卵囊无感染性，卵囊需在适宜的温度下(22～32℃)经过1～2周左右的孢子化过程才具有感染性。
[0003]19世纪90年代以前仅有散在的环孢子虫病的流行，以后，环孢子虫感染在全球范围内大规模暴发。环孢子虫病最初主要发生于尼泊尔、印度尼西亚、危地马拉、约旦等国家，因此被认为是发展中国家的地方性疾病。后来，环孢子虫病在美国、加拿大、德国、墨西哥和土耳其等国家相继暴发，其暴发流行通常与前往发展中国家的旅行者或食用进口新鲜食品有关。在我国河南、云南、陕西、安徽、广东和浙江等省份也报道了多起环孢子虫感染病例。
[0004]目前，环孢子虫常用的检测方法主要为直接涂片法、染色显微镜检查、流式细胞仪检测与及核酸检测。因其卵囊微小，故直接涂片法与显微镜检查存在一定的漏检和误诊；流式细胞仪的设备复杂、成本较高，不适宜大规模推广应用。以上方法对环孢子虫的检测均有一定的局限性，限制了环孢子虫暴发流行的及时检测和溯源。分子生物学方法因其高灵敏度、快速、廉价的特点被国内外研究人员所青睐，也成为环孢子虫检测研究的一个热点和趋势。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供环孢子虫实时荧光RAA检测试剂盒，使其能够快速、有效地对环孢子虫进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；
[0008]所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；
[0009]所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
[0010]所述探针的序列如SEQ ID No.7所示。
[0011]优选的，所述探针为在SEQ ID No.7所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。
[0012]优选的，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3和Cy5中任意一
种。
[0013]优选的，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中任意一种。
[0014]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。
[0015]优选的，所述试剂盒中包括：引物探针组合物40～80μL，所述上游引物和下游引物的独立浓度为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；RAA基础荧光通用反应试剂150～250μL；反应缓冲液1000～1800μL；阴性质控品25～35μL,成份为ddH2O；浓度为1.0
×
105copies/μL的阳性质控品。
[0016]优选的，所述阴性质控品为ddH2O。
[0017]优选的，所述阳性质控品为含有环孢子虫DNA片段的质粒，所述环孢子虫DNA片段的序列如SEQ ID No.10所示。
[0018]优选的，所述RAA基础荧光通用反应试剂组份包含重组酶，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，dNTPs。
[0019]优选的，所述反应缓冲液包括：450～550mM的Tris
‑
HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000。
[0020]优选的，所述试剂盒在使用时，实时荧光RAA反应体系每50μL包括：RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉，47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品、阴性质控品、阳性质控品。
[0021]所述实时荧光RAA反应的条件包括：所述实时荧光RAA反应的温度为30～45℃，所述实时荧光RAA反应的时间为15～20min。
[0022]RAA(Recombinase Aided Amplification)，重组酶介导的等温扩增技术，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件37℃下，重组酶与引物形成聚合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋。在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，使引物和模板之间发生链替换，新的DNA片段可以在体外快速地扩增出来。在单链结合蛋白以及缩合剂聚乙二醇(PEG10000)存在的条件下，不断重复这一过程而最终实现核酸的高效扩增，5
‑
20分钟之内就可以将目的基因扩增放大几百万倍，达到可以用仪器检测到的水平。RAA具有扩增时间短(<20min)、反应温度区间大(37
‑
42℃)、操作简便、不需要昂贵仪器等特点。
[0023]本专利技术通过大量的对比实验筛选到一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的序列如SEQ ID No.7所示，所述探针的荧光报告基团修饰在离5
’
端碱基数31bp位置上，所述探针的淬灭基团修饰在离3
’
端碱基数16bp位置上；所述荧光报告基团与淬灭基团之间的碱基位置，由四氢呋喃残基修饰。该特定的引物探针组达到了其他引物探针组所预料不到的检测特异性和灵敏度。本专利技术实施例1
‑
实施例3的结果显示：本方法与实时荧光PCR法相比具有以下优点：1)灵敏度：自建立的实时荧光RAA法最低检测限与现有的实时荧光PCR法最低检测限等同，均为10拷贝/μL；2)耗时：实时荧光PCR法一个实验轮回耗时为72min，而自建立的RAA法一个实验轮回为20min；3)仪器：目前现有的实时荧光PCR法检测仪器较大不适用于现场检测，而
RAA法所用仪器体积小，携带方便，适用于现场检测。
附图说明
[0024]图1、图2为实施例2的检测扩增图；图1为实时荧光RAA检测结果；图2为实时荧光PCR检测结果；阴性对照即试剂盒中阴性质控品；
[0025]图3为实施例3的检测扩增图；图3中，阴性对照即试剂盒中阴性质控品；
[0026]图4为实施例4的检测扩增图；图4中，NC：阴性对照；10
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为在SEQ ID No.7所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3和Cy5中的任意一种。4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中的任意一种。5.一种试剂盒，包括权利要求1～4任意一项所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：所述引物探针组合物40～80μL，所述上游引物和下游引物的独立浓度为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；24管RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉；反应缓冲液1000～1800μL；阴性...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉娟，姜岩岩，许洁，曹建平，应清界，刘燕红，顾赛艺，
申请(专利权)人：江苏奇天基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：