一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法，对传统的固定方法进行了改进，在不损害包囊的情况下，利用戊二醛和Tritan X

【技术实现步骤摘要】
一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种透射电镜样品的制备方法，具体涉及一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法，属于透射电镜样品制备


技术介绍

[0002]原生动物的包囊主要分为“休眠包囊”、“传染包囊”和“繁殖包囊”三种。“休眠包囊”是原生动物为应对不利环境而形成的一种休眠态，常见于营自由生活的纤毛虫(包囊游仆虫和冠突伪尾柱虫等)；“传染包囊”是高等动物寄生虫生活史中的传播阶段，其几丁质包囊壁具有耐酸性，可防止虫体被宿主消化(痢疾内变形虫和兰帕贾第虫等)；而与上述两种不同的是，发生正常细胞分裂并产生幼虫的包囊是“繁殖包囊”，是生物生活史中的一个特定变态时期，是在离体情况下自发调控形成的。该类型的包囊常见于鱼类的寄生原生动物中，如多子小瓜虫、眼点淀粉卵涡鞭虫和刺激隐核虫等。对原生动物包囊的研究目前已引起足够的重视。多年来，许多研究重点关注包囊的结构及形成，细胞皮层纤毛小器官的脱分化和再分化，以及各种包囊现象与原生动物系统进化的联系。特别是研究包囊的内部细微结构特点，有助于深入了解寄生虫的发育规律，为病害的防治提供理论依据，为新的研究手段和药物的开发提供新的思路，并且能够有效的说明寄生虫地域差异和生物进化中的许多机制，为开发生物能源和促进大自然的生态平衡等提供科学的基础，因此如何借助现代科学技术方法研究微观世界的奥妙是十分重要的。
[0003]透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)是研究生物超微结构的一项重要工具。其分辨率高达0.2nm，可以观测到大部分细胞的微小结构，满足单细胞微生物的观测需求，应用范围极广。透射电镜成像是通过电子枪发出高速电子束经过1
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2级聚光镜会聚后均匀照射到样品的观察区上，入射电子与样品发生碰撞与非碰撞，由于样品很薄，大部分电子穿透过样品，其强度分布与所观察样品区的形貌、组织、结构一一对应。投射出样品的电子经过物镜、中间镜和投影镜的三级磁透镜放大投射在观察图像的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，在荧光屏上显出与样品形貌、组织、结构相应的图像以供实验所需。
[0004]TEM样品制备好坏是能否准确观察到细胞中的微观结构的重要前提。传统的透射电镜超薄切片的制样过程一般包括取样、固定、浸洗、脱水、包埋、渗透、聚合、切片及染色等步骤。虽然制样方法具有单一性，但是样品的多样性使制样结果参差不齐。由于原生动物包囊结构的特殊性，在细胞的外围形成了一圈“包囊壁”。包囊壁是原生动物细胞的衍生物，是细胞的“铠甲”，他为细胞提供了一个保护性的微环境，可阻隔掉大量化学药物等不利因素对原生质体的伤害。原生动物的包囊壁一般为形态各异的多层结构，不同的生物组成各不相同。如刺激隐核虫的包囊壁在形态上是一个厚约4μm，由3个不同电子密度区域构成的多片层结构，中间部分较为紧实，厚约为包囊壁的一半，内侧和外侧的结构较为疏松。
[0005]因此要想使用透射电镜的方法观察包囊的内部微观结构，样品制备方法和技巧将成为制样是否成功的关键。要想制备出好的样品，得到清晰可视的图像则需要克服以下多
种困难：1.保证样品的尺寸是最佳大小；2.固定液能够快速穿过包囊壁渗透到包囊的内部；3.脱水剂能够在较短的时间内进入包囊并取代细胞中的游离水；4.包埋剂能够充分渗透进入包囊等。只要其中的某一个步骤没有处理好，都将导致制样失败，所得的内部结构出现不同程度的降解。然而，就目前的实验方法和操作技术来看，制作的原生动物包囊电镜样品的质量鱼龙混杂，包囊内部经常出现不同程度的空洞，难以准确并大视野的观察包囊内部的细胞器结构，细胞的超微结构难以清晰呈现，失败率较高。并且没有一套较为标准的制样方法，制样往往是凭借个人经验，所得的结果存在不稳定性，不可重复性等特点。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的制备原生动物包囊TEM样品时存在的包囊内部降解、失败率高、细胞的超微结构难以清晰呈现、制样结果的不稳定性和不可重复性等技术不足，而提供一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法。本专利技术通过多次的实验检验，结合实验经验，根据原生动物包囊的特性，在传统的样品制备方法上，对包囊固定的方法及包埋剂的选择进行优化，并对浸洗、脱水、包埋的时间进行改进，增加了部分制样过程中的技巧，能够使包囊的超微结构完整清晰呈现，结果稳定，重复性强，解决了以往制样中细胞质大量降解等技术问题。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法，包括以下步骤：
[0009]选取需要的原生动物包囊期细胞或实验处理后的包囊作为样品，利用固定液I对选取的包囊进行固定处理，固定处理结束后利用漂洗液对固定的包囊进行漂洗处理，漂洗处理结束后再利用固定液II对漂洗后的包囊进行二次固定处理，二次固定处理结束后利用漂洗液对二次固定处理后的包囊进行二次漂洗处理，二次漂洗处理结束后利用有机溶剂对二次漂洗处理后包囊进行脱水处理，脱水处理结束后利用利用包埋剂对脱水后包囊进行渗透、包埋处理，包埋处理结束后依次对包囊进行聚合、切片、染色处理，得到原生动物包囊透射电镜样品，最后对得到原生动物包囊透射电镜样品进行验证观察。
[0010]上述技术方案中，所述的制备方法，具体包括以下步骤：
[0011](1)取样：
[0012]选取需要的原生动物包囊期细胞或实验处理后的包囊作为样品，选取的包囊为休眠包囊、传染包囊或繁殖包囊的单个包囊，选取的单个包囊直径不宜过大、但发育良好，并且在处理前在光学显微镜下观察包囊的发育情况是否为预期的效果；
[0013](2)固定处理：
[0014]将步骤(1)中选取的单个包囊转移到载玻片的一角，吸干多余的培养液，利用固定液I将包囊冲洗至装有少量固定液I的玻璃固定缸中(当包囊冲入固定缸之后，整个包囊都浸泡在固定缸中)，小心的震荡玻璃固定缸中的包囊5min；然后，将样品小心的转移至2mL的离心管中并加入1mL固定液I，室温下静置1小时；随后将样品转移至4℃冰箱里避光固定处理24小时，固定处理时保持离心管平躺放置，有利于固定液与样品的充分接触；
[0015](3)漂洗处理：
[0016]将步骤(2)中经过固定处理后得到的样品先利用灭菌海水漂洗一次，然后再利用漂洗液对样品漂洗三次，一共浸洗4次；每次漂洗时将样品放入均置仪中，加入灭菌海水或
者漂洗液后进行震荡漂洗，每次浸洗前需小心的尽量吸干上一步骤中的灭菌海水或者漂洗液，震荡漂洗时在室温下进行；
[0017](4)二次固定处理：
[0018]将步骤(3)中经过漂洗处理后得到样品中的漂洗液吸至只剩最后一滴，然后立即加入一滴固定液II，随后将样品转移至4℃冰箱里进行二次固定处理；二次固定处理时避光且保持离心管平躺放置，处理时间为1.5
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2小时；
[0019](5)二次漂洗处理：
[0020]将步骤(4)中经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原生动物包囊透射电镜样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：选取需要的原生动物包囊期细胞或实验处理后的包囊作为样品，利用固定液I对选取的包囊进行固定处理，固定处理结束后利用漂洗液对固定的包囊进行漂洗处理，漂洗处理结束后再利用固定液II对漂洗后的包囊进行二次固定处理，二次固定处理结束后利用漂洗液对二次固定处理后的包囊进行二次漂洗处理，二次漂洗处理结束后利用有机溶剂对二次漂洗处理后包囊进行脱水处理，脱水处理结束后利用利用包埋剂对脱水后包囊进行渗透、包埋处理，包埋处理结束后依次对包囊进行聚合、切片、染色处理，得到原生动物包囊透射电镜样品，最后对得到原生动物包囊透射电镜样品进行验证观察。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)取样：选取需要的原生动物包囊期细胞或实验处理后的包囊作为样品，选取的包囊为休眠包囊、传染包囊或繁殖包囊的单个包囊，选取的单个包囊直径不宜过大、但发育良好，并且在处理前在光学显微镜下观察包囊的发育情况是否为预期的效果；(2)固定处理：将步骤(1)中选取的单个包囊转移到载玻片的一角，吸干多余的培养液，利用固定液I将包囊冲洗至装有少量固定液I的玻璃固定缸中(当包囊冲入固定缸之后，整个包囊都浸泡在固定缸中)，小心的震荡玻璃固定缸中的包囊5min；然后，将样品小心的转移至2mL的离心管中并加入1mL固定液I，室温下静置1小时；随后将样品转移至4℃冰箱里避光固定处理24小时，固定处理时保持离心管平躺放置，有利于固定液与样品的充分接触；(3)漂洗处理：将步骤(2)中经过固定处理后得到的样品先利用灭菌海水漂洗一次，然后再利用漂洗液对样品漂洗三次，一共浸洗4次；每次漂洗时将样品放入均置仪中，加入灭菌海水或者漂洗液后进行震荡漂洗，每次浸洗前需小心的尽量吸干上一步骤中的灭菌海水或者漂洗液，震荡漂洗时在室温下进行；(4)二次固定处理：将步骤(3)中经过漂洗处理后得到样品中的漂洗液吸至只剩最后一滴，然后立即加入一滴固定液II，随后将样品转移至4℃冰箱里进行二次固定处理；二次固定处理时避光且保持离心管平躺放置，处理时间为1.5
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2小时；(5)二次漂洗处理：将步骤(4)中经过二次固定处理后得到样品中的固定液II吸干，并立即加入漂洗液对样品漂洗三次；每次漂洗时将样品放入均置仪中，加入漂洗液后进行震荡漂洗，每次浸洗前需小心的尽量吸干上一步骤中的漂洗液；(6)脱水处理：将步骤(5)中经过二次漂洗处理后得到样品中的漂洗液吸干，先利用由低至高不同浓度的酒精对样品进行逐级脱水处理，然后再利用由低至高不同浓度的丙酮继续对样品进行逐级脱水处理，取代样品中的游离水；(7)包埋处理：将步骤(6)中经过脱水处理后得到的样品利用不同浓度的包埋剂进行逐步的组织渗透处理；
(8)聚合处理：将步骤(7)中经过包埋处理后得到的样品在70℃下聚合24小时，然后在60℃下处理36小时；(9)切片：切片包括修块和切片，将经过步骤(8)聚合处理后得到的样品从离心管中取出磨成适合切块的长度，长度为1cm，随后在切片机上进行连续超薄切片；(10)染色处理：将步骤(9)切片后得到的超薄切片利用染色剂进行染色，使重金属盐与细胞的一些结构和成分结合，增加电子的散射能力，进而达到提高反差的目的，使呈现的图片清晰可见；染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：周理耀，尹飞，詹萍萍，孔进东，谢骁，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：