突变的米曲霉菌株制造技术

本发明专利技术涉及突变的米曲霉菌株。具体地，本发明专利技术涉及突变的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，其相对于未突变的菌株，内源酶，例如淀粉酶和/或外源蛋白，如食品用脂肪酶，优选选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的生产能力提高。本发明专利技术还涉及所述菌株的各种用途。本发明专利技术还涉及所述菌株的各种用途。

【技术实现步骤摘要】
突变的米曲霉菌株


[0001]本专利技术涉及微生物领域，更具体涉及突变的米曲霉菌株和采用该菌株得到的重组菌株、生物催化剂等，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。

技术介绍

[0002]米曲霉 (Aspergillus oryzae) 是发酵工业常用的菌株，为好气真菌，属曲霉属，半知菌亚门。米曲霉生产酱油、豆面酱、清酒等许多发酵食品的历史可追溯到1000多年以前, 被美国食品与药品管理局（FDA）列为GRAS( Generally Regards As Safe) 级别并得到了世界卫生组织的认可（ MachidaM. Progress ofAspergillus oryzae genomics. AdvAppl Microbio,l 2002, 51: 81，106），是丝状真菌中应用非常普遍的种属，广泛应用于食品酿造行业、工业酶制剂行业。
[0003]米曲霉是一种能产复合酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、植酸酶等的菌株，且米曲霉还具有高效的蛋白分泌表达能力。米曲霉表达外源蛋白具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点，且表达的外源蛋白具有天然活性。另外，米曲霉还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰蛋白酶切割和二硫键的形成等（Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungi-progress, obstacle and future trends. Biotechnol Adv, 2008, 26(2):177-185）。因而，利用米曲霉作为表达菌株来表达同源和异源蛋白日益受到重视。
[0004]在工业生产过程中，米曲霉表达异源蛋白相较于同源蛋白时，表达水平较低（张建军，蔡容华，李强，等. 提高蛋白质在米曲霉中表达量的策略. 中国生物工程杂志，2009，29(1) : 111-115）。通常可以采取构建自身蛋白酶缺陷株、使用强启动子、融合表达等策略增强外源蛋白在米曲霉中的表达。但蛋白酶缺陷菌株一般会影响菌株的生长速度，不利于工业生产，而融合表达在食品用酶生产过程中可能存在法规风险，所以使用强启动子的策略一般较为常用。
[0005]另外合适的筛选标记是表达系统重要的组成部分。米曲霉中的营养缺陷型筛选标记目前使用最多的是硝酸盐还原酶营养缺陷型( niaD
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) 转化系统和乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型( pyrG
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) 转化系统（于潇淳，马世良. 米曲霉外源表达系统研究进展. 中国生物工程杂志，2016，36(9) : 94-100）。但是由于米曲霉的菌丝是多核有隔的而绝大部分分生孢子也是多核的，所以使得诱变或基因改造的效率大打折扣，增加了转化系统的建立难度（Jun-ichi MARUYAMA., Visualization of Nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and Analysis of the Number of Nuclei in Each Conidium by FACS.Biosci.Biotechnol.Biochem,65(7),1504-1510,2001）。
[0006]在我国，应用于食品中的酶制剂必须符合中华人民共和国国家标准GB2760-食品国家标准\食品添加剂使用标准。其中符合法规的常用的异源表达食品用脂肪酶：米黑根霉（Rhizomucor miehei）、棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）来源的脂肪酶均只能由米曲霉来进行异源表达，体现了米曲霉表达
系统在食品用酶生产的重要性。但根据现有文献，由米曲霉来进行异源表达食品用脂肪酶，其表达量往往非常低，例如：王斌在米曲霉营养缺陷型宿主菌 (Aspergillus oryzae niaD300 , niaD
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)中表达米黑根霉（Rhizomucor miehei）来源的脂肪酶RML，取培养7天的培养液上清，采用碱滴定法测定其酶活只有2.5 U/mL（王斌，潘力，郭勇. 丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建. 华南理工大学学报，2009，37(6) : 84-90），因而，无法满足行业需求。
[0007]因此，本领域仍然需要能够高效表达各种蛋白，尤其是食品用脂肪酶的米曲霉菌株。

技术实现思路

[0008]本专利技术以米曲霉CICC2012为出发菌株，构建了乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型( pyrG
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)菌株，并通过ARTP诱变提高了其蛋白表达能力，使之成为有效的异源表达宿主，其可以高效异源表达各种蛋白，尤其是食品用脂肪酶。
[0009]具体地，本专利技术涉及以下方面。
[0010]一方面，本专利技术涉及突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株，其相对于未突变的菌株，内源酶，例如淀粉酶和/或外源蛋白，如食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的生产能力提高。在本专利技术中，术语“内源酶”指的是突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株自身表达的酶，例如，包括但不限于突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株自身表达的淀粉酶。
[0011]在一个具体实施方案中，本专利技术的突变的米曲霉菌株具有CGMCC No.18825的保藏号。
[0012]本专利技术的新的米曲霉菌株能够高效表达异源蛋白。本专利技术的米曲霉菌株是乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型菌株，内源的淀粉酶表达量较出发菌株可以提高40%以上，例如40%-100%，特别是40%-60%，尤其是45%-55%。在异源表达RML时，比出发菌株的蛋白表达水平的提高了50%-100%，特别是50%-80%，尤其是55%-70%。此外，在表达TLL和FOL时，蛋白表达水平比出发菌株CICC2012相比，提高了40%以上，特别是40-50%。因此，该菌株具有显而易见的高效表达异源蛋白的实用性。
[0013]另一方面，本专利技术涉及重组米曲霉菌株，其通过在上述突变的米曲霉菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶。
[0014]另一方面，本专利技术涉及生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入上述突变的米曲霉菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白。或者，包括培养上述重组米曲霉菌株以产生目标蛋白。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶。
[0015]另一方面，本专利技术涉及生物催化剂，其包含上述突变的米曲霉菌株，其中引入了编码外源酶，例如食品用脂肪酶，例如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的基因。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株，其是乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型菌株，并且其相对于未突变的菌株，内源酶，例如淀粉酶和/或外源蛋白，如食品用脂肪酶，优选选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的生产能力提高。2.突变的米曲霉菌株，其保藏号为CGMCC No.18825。3.重组米曲霉菌株，其通过在权利要求1或2的菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。4.权利要求3的重组米曲霉菌株，其中所述外源蛋白是酶，优选食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶。5.生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入权利要求1或2的菌株，并且培养所述菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟，戴小军，曹海生，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：