用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于人β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(以下简称BACE1)的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，所述的试剂盒包括校准品、质控品、磁微粒混悬液、抗体标记物、浓缩洗液、发光底物；所述的校准品由BACE1抗原配置而成；所述的质控品为含有一定浓度的BACE1抗原，由质控品稀释液配置而成；所述的磁微粒混悬液含有一定浓度磁微粒标记的BACE1抗体溶液。本发明专利技术的有益效果是，本发明专利技术的试剂盒具有灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好、快速定量检测的优点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及试剂盒检测
，特别是用于检测人β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer
’
s Disease，AD)是一种伴有认知、行为和功能失常的进行性的常见神经退行性疾病，其主要病理特征为老年斑形成、神经元缺失、神经原纤维缠结。主要影响老年人的认知以及行为能力，主要影响60岁以上的人群，目前还没有有效的治疗手段。其发病主要与淀粉样β蛋白(β
‑
amyloid，AP)异常沉积有关。老年斑的主要组分即为Aβ，由β淀粉样前体蛋白(β
‑
amyloid precursor protein，APP)相继被β
‑
分泌酶和γ
‑
分泌酶切割后形成。目前β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)和β位点APP裂解酶2(BACE2)被认为是两个主要的β
‑
分泌酶。研究表明BACE1在β淀粉样前体蛋白过程中起到关键的作用。故在此过程中，脑脊液中BACE1的含量可以较好地反映神经元的活性。
[0003]人β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)，是在外周神经细胞中形成髓鞘的一种重要的天冬氨酸蛋白酶，是一种包含两个活性位点的跨膜蛋白。神经细胞通过神经突互相联系，阿尔茨海默疾病患者中，神经原轴突显示进行性退化，BACE1被认为是预测阿尔茨海默疾病进展的较好的生物标志物。目前可用于β位淀粉样前体蛋白裂解酶1检测方法主要有放射免疫测定法RIA，酶联免疫法(ELISA)和免疫层析法等。这些方法均有一定的缺陷，RIA污染大，ELISA法操作过程复杂，检测时间过长，不利于实现BACE1的自动化检测，免疫层析法检测重复性差、灵敏低。因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高，特异性好的BACE1的快速定量检测试剂盒及其使用方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒。本专利技术的试剂盒具有灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好、快速定量检测的优点。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，本专利技术所述的试剂盒包括校准品、质控品、磁微粒混悬液、抗体标记物、浓缩洗液、发光底物；所述的校准品由BACE1抗原配置而成；所述的质控品为含有一定浓度的BACE1抗原，由质控品稀释液配置而成；所述的磁微粒混悬液含有一定浓度磁微粒标记的BACE1抗体溶液。
[0006]本专利技术所述的磁微粒混悬液制备方法如下所示。
[0007]1)洗涤：20μL磁微粒原液，磁架上分离弃去上清液，加入300μL MES缓冲液，混匀5分钟，磁架上分离弃去上清液，反复洗涤5次；
[0008]2)活化：加入50μL的50mg/mLEDC、50mg/mL NHS，200r/min，活化0.5
‑
1h；EDC溶液是将EDC试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到，NHS溶液是将NHS试剂溶解于pH5.0的
100mM的MES缓冲液中得到；
[0009]3)洗涤：将上述溶液置于磁架上分离，弃去上清液，加入300μL MES缓冲液，混匀，磁架上分离弃去上清液，洗涤2次；
[0010]4)包被：加入MES缓冲液和预包被抗体，磁微粒和抗体的质量比为80:1，混匀后，室温反应10
‑
16h；
[0011]5)封闭：将上述溶液置于磁架上分离，弃去上清液，加入100
‑
300μL磁微粒封闭液，摇匀后，室温反应10
‑
16h；
[0012]6)将上述溶液置于磁架上分离，弃去上清液，加入一定的磁珠封保液，得到BACE1磁微粒混悬液。
[0013]本专利技术所述的抗体标记物为含有一定浓度的碱性磷酸酶标记的BACE1抗体溶液或吖啶酯标记的BACE1抗体溶液。
[0014]本专利技术所述的碱性磷酸酶标记抗体制备方法如下所示。
[0015]1)BACE1抗体与碱性磷酸酶，碱性磷酸酶的质量为抗体的2倍，分别除盐、浓缩，然后加入活化剂，室温，分别活化30min。除盐使用SepHadex G25凝胶柱子除盐。BACE1抗体活化用到的活化剂为2IT(2
‑
Iminothiolane hydrochloride)，碱性磷酸酶活化用到的活化剂为SMCC(Succinimidy 4
‑
(N
‑
maleimidomethy1)cyclohexane
‑1‑
carboxylate)；
[0016]2)活化后的BACE1抗体与碱性磷酸酶可按照质量比例进行混合后反应。然后进行终止反应和分离纯化，除去未结合的BACE1抗体与碱性磷酸酶，制备得到抗体标记物浓缩液，保存于2
‑
8℃。终止反应过程中，首先加入10mM马来酰亚胺，室温反应10min。再加入乙醇胺100mM的量。分离纯化柱为SuperdexTM200。
[0017]本专利技术所述的吖啶酯标记抗体制备方法如下所示：
[0018]1)BACE1抗体与吖啶酯，吖啶酯的质量为抗体的50倍，充分混匀，37度反应2小时以上，加入赖氨酸终止反应；
[0019]2)将标记后的吖啶酯标记抗体用脱盐层析柱纯化，收集纯化后的吖啶酯标记抗体。
[0020]本专利技术试剂盒检测方法如下所示：
[0021]1)免疫反应：25μL样本/质控品、20μL磁微粒、50μL抗体标记物，37℃温育30min，洗涤6次。
[0022]2)磁分离：在磁场中将磁微粒沉降，去上清，加入100μL的洗涤液，在磁场中将磁微粒沉降，去上清，重复3次，除去未结合的抗体；
[0023]3)检测读数：加入发光底物，室温反应，5min内检测发光值。
[0024]4)计算：该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与BACE1的含量成正比。选择适当的曲线拟和方式建立标准曲线。本试剂盒推荐采用四参数拟和方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光强度值的对数(log)值为y轴建立标准曲线，根据待测样品的发光强度值回算相应的浓度值。
[0025]本专利技术所述的校准品为含有BACE1抗原的校准品。
[0026]所述的校准品配置方法：用含有1％BSA的Tris缓冲液作为校准品稀释液，用校准品稀释液梯度稀释BACE1抗原，稀释至工作浓度，分别为1，40，80，200，400，800ng/mL。
[0027]本专利技术所述的质控品为含有BACE1抗原的质控品。
[0028]所述的质控品配置方法：用含有1％BSA的Tris缓冲液作为质控品稀释液，BACE1抗原用质控品稀释液梯度稀释至80ng/mL和200ng/mL。
[0029]本专利技术所述试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括校准品、质控品、磁微粒混悬液、抗体标记物、浓缩洗液、发光底物；所述的校准品由BACE1抗原配置而成；所述的质控品为含有一定浓度的BACE1抗原，由质控品稀释液配置而成；所述的磁微粒混悬液含有一定浓度磁微粒标记的BACE1抗体溶液。2.根据权利要求1所述的用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的磁微粒混悬液制备方法如下所示：1)洗涤：20μL磁微粒原液，磁架上分离弃去上清液，加入300μL MES缓冲液，混匀5分钟，磁架上分离弃去上清液，反复洗涤5次；2)活化：加入50μL的50mg/mLEDC、50mg/mL NHS，200r/min，活化0.5
‑
1h；EDC溶液是将EDC试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到，NHS溶液是将NHS试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到；3)洗涤：将上述溶液置于磁架上分离，弃去上清液，加入300μL MES缓冲液，混匀，磁架上分离弃去上清液，洗涤2次；4)包被：加入MES缓冲液和预包被抗体，磁微粒和抗体的质量比为80:1，混匀后，室温反应10
‑
16h；5)封闭：将上述溶液置于磁架上分离，弃去上清液，加入100
‑
300μL磁微粒封闭液，摇匀后，室温反应10
‑
16h；6)将上述溶液置于磁架上分离，弃去上清液，加入一定的磁珠封保液，得到BACE1磁微粒混悬液。3.根据权利要求1所述的用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的抗体标记物为含有一定浓度的碱性磷酸酶标记的BACE1抗体溶液或吖啶酯标记的BACE1抗体溶液。4.根据权利要求3所述的用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的碱性磷酸酶标记抗体制备方法如下所示：1)BACE1抗体与碱性磷酸酶，碱性磷酸酶的质量为抗体的2倍，分别除盐、浓缩，然后加入活化剂，室温，分别活化30min；除盐使用SepHadex G25凝胶柱子除盐；BACE1抗体活化用到的活化剂为2IT，碱性磷酸酶活化用到的活化剂为SMCC；2)活化后的BACE1抗体与碱性磷酸酶可按照质量比例进行混合后反应；然后进行终止反应和分离纯化，除去未结合的BACE1抗体与碱性磷酸酶，制备得到抗体标记物浓缩液，保存于2
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8℃；终止反应过程中，首先加入10mM马来酰亚胺，室温反应10min；再加入乙醇胺100mM的量；分离纯化柱为SuperdexTM200。5.根据权利要求3所述的用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的吖啶酯标记抗体制备方法如下所示：1)BACE1抗体与吖啶酯，吖啶酯的质量为抗体的50倍，充分混匀，37度反应2小时以上，加入赖氨酸终止反应；2)将标记后的吖啶酯标记抗体用脱盐层析柱纯化，收集纯化后的吖啶酯标记抗体。6.根据权利要求1所述的用于BACE1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：试剂盒检测方法如下所示：
1)免疫反应：25μL样本/质控品、20μL磁微粒、50μL抗体标记物，37℃温育30min，洗涤6次；2)磁分离：在磁场中将磁微粒沉降，去上清，加入100μL的洗涤液，在磁场中将磁微粒沉降，去上清，重复3次，除去未结合的抗体；3)检测读数：加入发光底物，室温反应，5min内检测发光值；4)计算：该复合物催化...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙月鹏，胡秀丽，张娟丽，
申请(专利权)人：中秀科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：