一种布鲁氏杆菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种布鲁氏杆菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用，具体为一种原核表达的布鲁氏杆菌外膜蛋白的串联表位蛋白，包括牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)、猪种布鲁氏杆菌(B.suis)、犬种布鲁氏杆菌(B.canis)的第二组外膜蛋白OMP2蛋白以及第三组外膜蛋白中的OMP25、OMP31、OMP28、OMP22蛋白的抗原表位。该疫苗具备良好的安全性与有效性，牛、羊经过肌肉或皮下注射后，可激发良好的抗体水平。可激发良好的抗体水平。可激发良好的抗体水平。

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏杆菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，涉及一种布鲁氏杆菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏杆菌是一种革兰氏阴性的胞内寄生菌，目前已经确认的布鲁氏杆菌有9个种，其中宿主为陆生动物的有7个种，分别为牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、绵羊睾丸种(B.ovis)、犬种(B.canis)、沙林鼠种(B.neotomae)与田鼠种(B.microti)。宿主为海洋动物的有2个种，分别为鲸鱼种(B.ceti)与海豹种(B.pinnipedialis)。其中羊种、牛种、猪种、犬种布鲁氏杆菌是一种传播性极强、宿主广泛的病原菌，尤其以羊种布鲁氏杆菌的致病性最强，可通过皮肤、口腔、粘膜、交配进入动物体内感染致病，且患病个体可通过乳液、精液、脓液、阴道分泌物等多种途径向体外传播。
[0003]布鲁氏杆菌病属于重大人畜共患传染病，对人和动物的危害都极大，与狂犬病、非典型肺炎、高致病性禽流感等同属于乙类传染病。现有的牛种布鲁氏菌S19株活疫苗、猪种布鲁氏菌S2株活疫苗及羊种布鲁氏菌M5株活疫苗在布鲁氏菌病防控工作中起到了重要的作用。但这三种疫苗的应用均存在不足：(1)安全性差，不能接种于孕畜、种畜、奶畜；(2)疫苗接种动物与野毒感染动物无法鉴别；(3)疫苗对人与动物存在感染性，危害公共卫生安全。上述不足使得疫苗使用范围受到了一定限制，而且不能对种畜与奶畜使用。这导致大部分地区只能通过监测与捕杀来控制布氏杆菌病的流行，继续一种安全有效的布鲁氏杆菌疫苗。
[0004]外膜蛋白成为了布鲁氏杆菌的研究热点，并已发现外膜蛋白与布鲁氏杆菌在宿主内体鉄摄取等重要繁殖生长过程有关，且具备重要免疫原性与抗原保护作用。目前已经发现了7种外膜蛋白，并根据分子量大小可以分为三组外模蛋白。其中第一组外膜蛋白包括OMP10、OMP19等，与细菌结构稳定性方面有关；第二组外膜蛋白为OMP2，参与细菌营养物质运输；第三组外模蛋白包括OMP25、OMP31等，参与维持细菌的外模功能性结构的稳定。其中OMP25在布鲁氏杆菌感染、致病过程中发挥重要作用、OMP31与布鲁氏杆菌体在内寄生过程中摄取铁元素密切相关。因此，基于布鲁氏杆菌外膜蛋白研制一种安全有效的新型疫苗，对布鲁氏杆菌并的防控与净化以及公共卫生安全具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决上述问题，提供了一种布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白，利用其制备得到的疫苗用于牛、羊等动物，可安全有效的预防布鲁氏杆菌感染。
[0006]本专利技术目的之一在于提供一种布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白，对牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)、猪种布鲁氏杆菌(B.suis)、犬种布鲁氏杆菌(B.canis)的第二组外膜蛋白OMP2、第三组外膜蛋白中的OMP25、OMP31、OMP28、OMP22蛋白进行生物信息学分析，得到外膜蛋白的抗原表位。通过人工合成，制备包含所述外膜蛋
白抗原表位的串联表位DNA片段，将所述DNA片段连接到pET28a原核表达载体，构建串联表位蛋白重组表达载体(pET28a
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MutiE)，具体技术方案如下：
[0007]一种布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列由羊种Omp2a蛋白、羊种Omp2b蛋白、牛种Omp2b蛋白、猪种Omp2b蛋白、牛种Omp25蛋白、犬种Omp25蛋白、猪种Omp25蛋白、绵羊睾丸种Omp25蛋白、羊种Omp31蛋白、犬种Omp31蛋白、绵羊睾丸种Omp31蛋白、猪种Omp31蛋白、绵羊睾丸种Omp22蛋白、牛种Omp22蛋白、羊种Omp28蛋白和牛种Omp28蛋白的氨基酸序列组成。
[0008]具体的，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列由羊种Omp2a蛋白的22
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51位、144
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158位；羊种Omp2b蛋白的233
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245位、314
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336；牛种Omp2b蛋白的4
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29位；猪种Omp2b蛋白的41
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53位；牛种Omp25蛋白的4
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46位、187
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197位、143
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154位；犬种Omp25蛋白的87
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94位；猪种Omp25蛋白的120
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137位；绵羊睾丸种Omp25蛋白的10
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27位；羊种Omp31蛋白的19
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27位；犬种Omp31蛋白的4
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14位；绵羊睾丸种Omp31蛋白的95
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102位、224
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237位；猪种Omp31蛋白的72
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89位；绵羊睾丸种Omp22蛋白的157
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177位；牛种Omp22蛋白的74
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80位；羊种Omp28蛋白的240
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247位和牛种Omp28蛋白的103
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111位氨基酸序列组成。
[0009]具体的，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术目的之二在于提供过来一种布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白，具体的，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]本专利技术目的之三在于提供了一种表达布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的重组质粒，具体技术方案如下：
[0012]一种表达布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的重组质粒，所述重组质粒包含上述技术方案中的布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的核苷酸序列。
[0013]本专利技术目的之四在于请求保护一种利用上述技术方案中的重组质粒制备得到的基因工程菌株。
[0014]具体方法为将上述方案中的重组质粒转化宿主菌构建基因工程菌株，所述基因工程菌株经鉴定后制备布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白基因工程菌株种子株，所述宿主菌为大肠杆菌BL 21菌株。
[0015]进一步地，所述基因工程菌株的鉴定方法为将所述基因工程表达菌株用LB培养基在37℃条件下震荡培养至对数期，然后在LB培养基内添加终浓度为1mM的IPTG并继续培养2
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3小时。离心收集菌体沉淀，用冰冷的生理盐水按10:1(W/V)比例重悬菌体后，再离心收集菌体沉淀，重复2
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3次，去除培养基成分。菌体通过SDS
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PAGE电泳检测，与为未转化的大肠杆菌BL21宿主菌相比，在34kD处有明显条带。
[0016]进一步地，所述基因工程菌株的制备方法为，将经过鉴定的基因工程菌株用LB培养基在37℃条件下震荡培养至对数期，在洁净条件下收集菌液，按1:1比例加入冰冷的冻干保护剂并震荡混匀，分装后冷冻干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白，其特征在于，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列由羊种Omp2a蛋白、羊种Omp2b蛋白、牛种Omp2b蛋白、猪种Omp2b蛋白、牛种Omp25蛋白、犬种Omp25蛋白、猪种Omp25蛋白、绵羊睾丸种Omp25蛋白、羊种Omp31蛋白、犬种Omp31蛋白、绵羊睾丸种Omp31蛋白、猪种Omp31蛋白、绵羊睾丸种Omp22蛋白、牛种Omp22蛋白、羊种Omp28蛋白、和牛种Omp28蛋白的氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白，其特征在于，所述布鲁氏杆菌外膜蛋白串联表位蛋白的氨基酸序列由羊种Omp2a蛋白的22
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51位、144
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158位；羊种Omp2b蛋白的233
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245位、314
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336；牛种Omp2b蛋白的4
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29位；猪种Omp2b蛋白的41
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53位；牛种Omp25蛋白的4
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46位、187
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197位、143
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154位；犬种Omp25蛋白的87
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94位；猪种Omp25蛋白的120
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137位；绵羊睾丸种Omp25蛋白的10
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27位；羊种Omp31蛋白的19
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27位；犬种Omp31蛋白的4
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14位；绵羊睾丸种Omp31蛋白的95
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102位、224

【专利技术属性】
技术研发人员：曹政，付文贵，付利芝，何丹，鲍伟，穆德龙，张月，龙小玲，
申请(专利权)人：重庆棠城畜牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：