一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，旨在提供一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用。是将目的抗原SP

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学及生物医学
，涉及自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，以及基因工程化的嵌合纳米颗粒在疫苗领域的应用。

技术介绍

[0002]基于灭活的或减毒的病原体控制传染病的传统疫苗，其特点是具有有效的T细胞、B细胞反应和记忆免疫。尽管它们可以在宿主中诱导有效的免疫效力，但随着近来重要流行病的出现，对安全有效的疫苗策略的需求和关注日益增加。因此，考虑到与传统疫苗策略相比的优势，包括不存在完整病原体的致病因子，易于生产、生物安全和DIVA问题(受感染动物和接种疫苗的动物之间的区别)，基因工程亚单位疫苗已变得越来越流行。
[0003]通常，疫苗的免疫原性在很大程度上受到抗原的理化特性的影响。为了提高疫苗的免疫原性，具有出色免疫原性的经典灭活或减毒病原体可以提供关键参考，包括1)减毒病原体的复制能力2)高度重复和有序的表面抗原阵列3)微粒抗原的性质4)同时激活先天和适应性免疫的能力。基于这些发现，已提出了多种方法来增强亚基疫苗的免疫原性，其中包括通过与大型蛋白质载体或佐剂偶联来增加抗原大小，抗原多聚化以及在颗粒载体上表面高度重复的抗原表面展示。
[0004]具有生物活性的蛋白质分子相互作用并自我排列，形成与其自然状态下的功能密切相关的有序结构。这是自组织形成纳米颗粒的能力，在自组装蛋白纳米颗粒(SAPNs)中得到了很好的证明。SAPN通常由各种高度重复的基序组成，可以利用这些基元将外来抗原决定基或蛋白质整合到其结构中，因此可以将这些嵌入的分子表面展示在组装的颗粒上。这些嵌合的SAPN是在生物医学领域中抗原表位和蛋白质递送的理想载体。SAPN上外来抗原的空间排列类似于天然病原体上的病原体相关分子模式(PAMP)，其特征在于高抗原密度和高度有序的结构，从而增强了抗原与BCR之间的交联反应。这种多重相互作用与刺激有效免疫反应的关键步骤密切相关，并且它还为提高亚基疫苗的免疫原性提供了另一种解决方案。
[0005]对于疫苗递送，基于纳米粒子(NPs)的疫苗在引发适应性和先天免疫性方面，具有优于亚基可溶性抗原的许多改进特性。纳米级的颗粒可以改善抗原的吞噬作用，并通过抗原呈递细胞(APC)内在化。树突状细胞(DCs)作为最强大的APC，在启动有效的免疫反应中起关键作用，并且倾向于通过内吞作用内化纳米颗粒抗原，而不是可溶性抗原。与通常通过II类MHC途径呈递的可溶性蛋白抗原不同，NPs抗原内化到APC中可通过II类MHC和I类MHC途径促进交叉呈递和交叉启动，随后增强CD8
+
CTL免疫应答。而且，NP本身也作为递送系统发挥辅助作用。除了增强抗原内在化和呈递作用外，NP还可以促进先天免疫的激活，免疫刺激性细胞因子的分泌以及DC的成熟和迁移，这反过来又促进了免疫反应的初始化。
[0006]病毒样粒子(VLPs)是一种自组装的NP，已经在针对多种疾病的疫苗开发中取得了巨大成功，例如，基于许可的商用VLP疫苗，包括针对乙型肝炎，宫颈癌和戊型肝炎的疫苗，就是例证。疫苗在临床试验阶段针对不同的感染进行了评估。这些结果表明，基于NP的递送技术可增强适应性免疫和先天性免疫，从而产生强大的保护性免疫。
[0007]通常，各种各样的靶抗原通过基因工程融合表达或化学偶联与NPs连接并显示在表面上。在基于NPs的疫苗设计中，应考虑三个关键因素：插入片段大小(抗原/表位大小)，VLP形成能力，VLP稳定性和抗原/表位的表面展示。它们与基于NP的疫苗的免疫功效密切相关。先前的研究表明，基于二十面体纳米笼的计算设计，i301和mi3能够自我安排，自发形成高度有序的60个亚基十二面体NP，可作为基于NP的新型疫苗设计的有希望的替代品。尽管如此，包括插入能力和免疫效力等许多问题仍有待进一步验证。
[0008]猪瘟病毒(CSFV)的出现和反复流行构成持续的威胁，给养猪业造成巨大的经济损失。尽管毫无疑问，拉潘化减毒疫苗可以提供针对CSFV的全面保护，但它不具备DIVA特性。由于E2糖蛋白参与了免疫动物的中和抗体的诱导，因此有人提出将E2糖蛋白作为潜伏疫苗开发的主要目标。E2蛋白高度糖基化，这种糖基化与其免疫保护效率密切相关。仅真核生物来源的E2诱导有效的中和抗体，并且需要多次剂量才能获得足够的保护，阻碍了E2亚基疫苗在该领域的应用。因此，有必要进行改进以诱导亚单位疫苗更好和更广泛的保护功效。

技术实现思路

[0009]本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用。
[0010]为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：
[0011]提供一种猪瘟病毒(CSFV)自组装蛋白纳米颗粒，是将目的抗原SP
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E2和自组装分子的基因通过杆状病毒表达系统融合表达，形成SP
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E2
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mi3融合蛋白；然后进一步通过纳米组装，形成自组装蛋白纳米颗粒；所述目的抗原SP
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E2和自组装分子的基因(SP
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E2
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mi3基因)的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]本专利技术还提供了由前所述目的抗原SP
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E2和自组装分子的基因(SP
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E2
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mi3基因)编码的SP
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E2
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mi3融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本专利技术进一步提供了前述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)构建含有目标抗原SP
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E2及自组装分子基因的穿梭质粒，将其转化DH10Bac感受态细胞；进一步使其发生转座，通过蓝白斑筛选，获得重组杆粒；
[0015](2)将重组杆粒转染昆虫细胞，获得杆状病毒，并将杆状病毒在昆虫细胞上进行传代；
[0016](3)将P3代病毒液感染足量的昆虫细胞，纯化获得SP
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E2
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mi3融合蛋白；
[0017](4)通过透析的方式，将SP
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E2
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mi3融合蛋白的溶液环境替换为纳米颗粒组装液，在4℃条件下进行纳米组装，并使用透射电镜确认纳米颗粒的形成。
[0018]本专利技术进一步提供了利用前述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒进一步制备猪瘟病毒自组装纳米颗粒疫苗的制备方法，是将SP
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E2
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mi3融合蛋白与Seppic 206水佐剂充分混合、乳化，制得纳米颗粒疫苗。
[0019]本专利技术进一步提供了前述方法制备获得的猪瘟病毒自组装纳米颗粒疫苗在防治猪瘟病毒感染中的应用。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术通过自组装分子基因融合CSFV E2，通过杆状病毒表达系统表达和纯化得
到的融合蛋白，在体外可组装成SP
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒，其特征在于，是将目的抗原SP
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E2和自组装分子的基因通过杆状病毒表达系统融合表达，形成SP
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E2
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mi3融合蛋白；然后进一步通过纳米组装，形成自组装蛋白纳米颗粒；所述目的抗原SP
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E2和自组装分子的基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。2.由权利要求1所述目的抗原SP
‑
E2和自组装分子的基因编码的SP
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E2
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mi3融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有目标抗原SP
‑
E2及自组装分子基因的穿梭质粒，将其转化DH10Bac感受态...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽辉，何放，徐慧玲，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：