一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途，属于生物药学技术领域。本发明专利技术的重组蛋白包括结核分枝杆菌热休克蛋白65与6段串联重复的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白第33

【技术实现步骤摘要】
一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物药学
，尤其涉及一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统脱髓鞘为特征的自身免疫性炎症性神经退行性疾病。临床表现有感觉丧失、肌肉无力、言语困难、头晕、运动障碍甚至瘫痪等症状，不同症状取决于脑和脊髓的病变部位，MS至今尚无有效的治愈方法。临床常用疾病修正治疗药物(disease modifying therapies,DMTs)治疗MS，目前已有的DMTs药物包括：一线药物有干扰素(IFN
‑
β1b，IFN
‑
β1a)、醋酸盐格拉替雷(GA)；二线药物有富马酸二甲酯、芬戈莫德、特立氟胺、米托蒽醌、那他珠单抗、阿伦单抗等，但这种治疗方法只是降低疾病的复发率，延缓疾病的发展，另外，这些药物对MS的重症患者通常无效，并且会带来很大的副作用。
[0003]MS是中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病，诱发髓鞘特异性免疫耐受的抗原特异性疫苗有望成为安全有效的MS治疗药物。自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。在预防自身免疫性疾病的研究中，利用自身抗原开发疫苗是目前备受关注的方法。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)是诱发MS的主要自身抗原之一，其胞膜外区有三个致脑炎抗原表位，其中MOG
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‑
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(35MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK55)是MOG中的一段21个氨基酸组成多肽，是关键的抗原表位，它可以诱导C57BL/6小鼠出现典型的慢性
‑
非缓解性实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)症状，MOG
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‑
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抗原肽诱发的C57BL/6小鼠EAE模型是目前普遍使用的经典MS动物模型。自身抗原在自身免疫性疾病中扮演着双刃剑的角色，一方面，自身抗原是介导疾病发生的诱因，在疾病的发生发展过程中起到关键性的作用；另一方面，如果采用合适的免疫策略如可通过适当的免疫途径、剂量和周期来免疫自身抗原，有针对性地调节对自身抗原的免疫应答，进而诱发机体产生免疫耐受或者良性的调节性免疫应答，从而起到预防自身免疫性疾病的作用。
[0004]有鉴于此，有必要研究一种能代替现有DMTs药物的含有MOG
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‑
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抗原肽，通过改变免疫方式及诱导针对性地免疫调节，可以对自身抗原产生免疫耐受的药物成分，用于抗多发性硬化。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提出一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途，该重组蛋白由HSP65蛋白和MOG
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蛋白组成，其能起到预防多发性硬化的作用。
[0006]本专利技术的另一个目的在于提出上述抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，该制备方法可靠性强。
[0007]本专利技术的又一个目的在于提出上述抗多发性硬化的重组蛋白的用途，该蛋白用于
制备多发性硬化疫苗和/或用于制备多发性硬化药物，可达到较好的效果。
[0008]本专利技术的再一个目的在于提出上述多发性硬化疫苗或多发性硬化药物的施用方法，以滴鼻方式施用，该途径安全有效。
[0009]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种抗多发性硬化的重组蛋白，该重组蛋白包括HSP65蛋白和抗原表位多肽MOG
35
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蛋白。
[0011]进一步的，该重组蛋白包括一个HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG
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‑
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蛋白，即所述重组蛋白包括HSP65和6MOG
35
‑
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。
[0012]进一步的，所述HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG
35
‑
55
蛋白之间，通过柔性接头连接。
[0013]进一步的，所述HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG
35
‑
55
蛋白之间以Ala
‑
Ser
‑
Ala柔性接头连接。
[0014]进一步的，所述重组蛋白序列为SEQ ID NO.1。
[0015]一种抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，该方法用于制备上述的抗多发性硬化的重组蛋白；该方法包括以下步骤：
[0016](1)构建重组质粒pET28a
‑
His
‑
HSP65
‑
6MOG
35
‑
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，获得具有该重组质粒的工程菌；
[0017](2)对以LB培养基工程菌进行培养，当菌体达到对数生长期时，培养基中加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度为5mmol/L，继续培养7小时后收集菌体；
[0018](3)以收集的菌体分离融合蛋白和对融合蛋白纯化，得到所述的抗多发性硬化的重组蛋白。
[0019]进一步的，所述步骤(1)包括以下步骤：
[0020]将6MOG
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‑
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的密码子插入pET
‑
28a(+)，获得质粒pET28a
‑
6MOG
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‑
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；
[0021]以为质粒pET28a
‑
6MOG
35
‑
55
模板进行PCR，扩增获得编码6MOG
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‑
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序列的目的基因片段；
[0022]将pET28a
‑
His
‑
HSP65
‑
6P277载体经NheI、HindIII双酶切，得到线性化克隆载体；
[0023]将编码6MOG
35
‑
55
序列的目的基因片段和线性化克隆载体重组，得到重组质粒，将重组质粒转化到感受态细胞并以PCR进行阳性克隆的筛选，对筛选所得阳性克隆体进行验证，最终得到具有该重组质粒的工程菌。
[0024]进一步的，所述步骤(3)中：
[0025]取收集的菌体裂解和冰上超声破碎，分别取上清液和沉淀进行分析，确定融合蛋白为包涵体；
[0026]以含有尿素的包涵体溶解液处理包涵体，收集上清液，用Ni
‑
NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白，得到重组蛋白His
‑
HSP65
‑
6MOG
35
‑
55
。
[0027本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白包括HSP65蛋白和抗原表位多肽MOG
35
‑
55
。2.根据权利要求1所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白包括一个HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG
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‑
55
，即所述重组蛋白包括HSP65和6MOG
35
‑
55
。3.根据权利要求2所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，所述HSP65蛋白和六段抗原表位多肽MOG
35
‑
55
之间，通过柔性接头连接。4.根据权利要求3所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，所述HSP65蛋白和六段抗原表位多肽MOG
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‑
55
之间以Ala
‑
Ser
‑
Ala柔性接头连接。5.根据权利要求4所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白序列为SEQ ID NO.1。6.一种抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求2
‑
5任一项所述的抗多发性硬化的重组蛋白；该方法包括以下步骤：(1)构建重组质粒pET28a
‑
His
‑
HSP65
‑
6MOG
35
‑
55
，获得具有该重组质粒的工程菌；(2)对以LB培养基工程菌进行培养，当菌体达到对数生长期时，培养基中加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度为5mmol/L，继续培养7小时后收集菌体；(3)以收集的菌体分离融合蛋白和对融合蛋白纯化，得到所述的抗多发性硬化的重组蛋白。7.根据权利要求6所述的抗多发性硬化的重组蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙云霄，饶军华，彭真，张礼标，李比海，何向阳，季芳，
申请(专利权)人：广东省科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：