SUMO-Harpin制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白及其制备和应用。具体涉及融合蛋白SUMO

【技术实现步骤摘要】
SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白及其生产方法和应用

：
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种融合蛋白及其制备和应用。具体涉及融合蛋白SUMO
‑
Harpin
Ea
、基因序列、制备方法，以及Harpin
Ea
在提高植物的免疫力和抗逆性、促进植物的发芽和生长中的应用。
技术背景：
[0002]与动物一样，植物在生长过程中，难免会受到昆虫、致病菌以及极端生存环境的侵袭。自从1901年Ray和Beauverie发现植物免疫现象以来，人们深入研究了对植物诱导抗病性，并已形成了系统理论。植物诱导抗病性(Induced resistance，IR)，也就是获得免疫性，在1982年由Kuc定义为：经外界因子诱导后，植物体内产生的对有害病原菌的抗性现象。
[0003]“超敏反应”(Hypersensitivity，HR)是Stakman在1915年首次使用的一个术语，用来描述锈菌在抗锈蚀谷物中引起的植物细胞快速和局部死亡的反应。在1994年，Goodman和Novacky将其定义为“植物细胞迅速死亡与病原体生长的限制”。HR可以不被限制在入侵病原体或与病原体直接接触的细胞上。如果足够的细胞死亡，可能会出现明显的褐色病变。
[0004]超敏蛋白Harpin
Ea
是由HrpN基因编码，在1992年由韦忠民等人从梨火疫病菌(Erwinia.amylovora)中分离出来的一种能够激发植物产生超敏反应的蛋白。HrpN是Harpin家族的三个成员之一。Harpin
Ea
蛋白在诱导植物产生抗性的前期，可以激发多种抗性机制，引发植物对病原物的广谱抗性。经过大量的研究表明，Harpin
Ea
激发植物产生防卫的过程中涉及到了三种传导途径：乙烯通路、脱落酸通路、系统获得性抗性，通过这些途径可使植物提高抗虫害、抗干旱、抗病性等。
[0005]小分子泛素样修饰蛋白SUMO(Small ubiquitin
‑
like modifier，SUMO)是与多种靶蛋白中的赖氨酸残基连接的蛋白质部分。SUMO的添加可以调节蛋白质与其配偶体相互作用的能力，改变它们的亚细胞定位模式并控制它们的稳定性。泛素化作为可逆的翻译后修饰过程，已被证实参与许多细胞内的反应过程，包括核细胞溶质转运，细胞凋亡，蛋白质活化，蛋白质稳定性，应激反应和细胞周期性生长。近年来，SUMO已成为一种有效的生物技术工具，作为一种融合系统，可增强蛋白质的可溶性表达，减少蛋白水解降解，这是传统表达系统无法实现的。
[0006]由此可见，Harpin
Ea
蛋白在提高植物抗病性方面具有至关重要的作用，因此提高Harpin
Ea
蛋白的产量及纯度对工业生产具有很大的意义。

技术实现思路
：
[0007]为了提高Harpin
Ea
蛋白的表达量和产量，本专利技术提供了一种利用SUMO标签对Harpin
Ea
进行修饰，从而实现高效的可溶性表达及纯化的方法，将SUMO蛋白与Harpin
Ea
蛋白进行融合表达，所述融合蛋白命名为SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白；
[0008]所述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白具体为：
[0009](1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或
[0010](2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或
[0011](3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列；
[0012]本专利技术还提供编码所述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白的核酸分子，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA；
[0013]进一步地，所述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO.2所示；
[0014]本专利技术的另一目的是提供含有上述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或重组菌；
[0015]进一步地，所述重组载体的表达载体可以是pET28a质粒、pET30a质粒或pBV222质粒等；
[0016]优选地，所述重组载体的表达载体为含有T7强启动子的pET28a(+)质粒；
[0017]进一步地，所述重组菌的宿主可以是大肠杆菌DH5α、BL21或C802等；
[0018]优选地，所述重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)；
[0019]本专利技术还提供上述重组菌的构建方法，是将经过密码子优化过的SUMO和Harpin
Ea
的编码基因进行融合后获得SUMO
‑
Harpin
Ea
基因，与表达载体进行酶切连接后转化入宿主细胞所得；
[0020]所述SUMO编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0021]所述Harpin
Ea
编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0022]进一步地，所述重组菌以含有T7强启动子的pET28a(+)质粒为载体，以E.coli BL21(DE3)为宿主，获得基因工程菌E.coli/SUMO
‑
Harpin
Ea
；
[0023]本专利技术还提供融合蛋白SUMO
‑
Harpin
Ea
的生产方法，具体如下：
[0024]将构建成功的E.coli/SUMO
‑
Harpin
Ea
基因工程菌接种至发酵培养基中，待OD
600
达到0.6
‑
1.8，添加IPTG诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni
‑
NTA亲和层析纯化后，可得纯度超过90％的SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白；
[0025]进一步地，培养条件为：以1
‑
10％的接种量接种发酵培养基，待OD
600
达到0.6
‑
1.8，添加IPTG至终浓度0.1
‑
0.6mM，15
‑
20℃，200rpm低温诱导16
‑
20h；经16
‑
20h诱导后，SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白的得率可以达到0.2
‑
1.7g/L发酵液；
[0026]进一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白，其特征在于，所述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白具体为：(1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或(3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白的核酸分子。3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。4.含有权利要求2或3核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。5.一种制备权利要求1所述SUMO
‑
Harpin
Ea
蛋白的方法，其特征在于，采用权利要求4所述的重组菌以1
‑
10％的接种量接种发酵培养基，待OD
600
达到0.6

【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱友，蔡增英，王众，孙冰，王立群，乔长晟，
申请(专利权)人：宁夏中宁枸杞产业创新研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：