一种SARS相关冠状病毒的灵长类动物模型及其构建方法和用途技术

一种ＳＡＲＳ相关冠状病毒灵长类动物感染模型。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种SARS相关冠状病毒的灵长类动物模型，尤其是恒河猴及食蟹猴动物模型，其构建方法以及用途。
技术介绍
重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的广泛流行严重威胁着人类的健康。国内外研究表明，SARS病原是一种变异的冠状病毒，长为29742bp的正单链RNA病毒，其RNA和RNA之间重组率非常高。虽然目前我国对SARS病原、诊断、来源等方面的研究均已取得一定进展，但尚缺乏合适的SARS感染动物模型，尤其是灵长类动物模型。因此，缺乏SARS动物模型已经成为限制预防和/或治疗SARS药物筛选、疫苗评价和发病机制等的研究瓶颈问题。虽然，已知建立了众多针对不同病原体的灵长类动物感染模型，但是针对造成SARS的冠状病毒变异株建立灵长类动物感染模型而言，在动物品种、健康状态的选择、感染病毒的处理、剂量、途径以及感染后的病毒检测、免疫血清学确定等环节存在大量技术问题亟待解决。国外仅有一篇关于SARS冠状病毒感染食蟹猴的信件短报(Nature，Vol.423，15MAY2003)，其中没有披露具体的构建方法，所得动物感染模型的效果也不甚清楚。本专利技术人有效的克服了现有诸多技术问题，成功的构建了中国恒河猴及食蟹猴SARS相关冠状病毒感染模型。在所述动物中感染的重复性、稳定性好，为进一步研究该病毒的病原特性、发病机理、药物筛选、疫苗评价等方面的研究奠定了重要基础。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种SARS相关冠状病毒灵长类动物感染模型，尤其是SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹猴感染模型。恒河猴与食蟹猴感染SARS相关冠状病毒后，均表现一度体温生高，产生抗SARS相关冠状病毒抗体IgM和IgG，体液分离病毒阳性，RT-PCR检测病毒阳性可达感染后20天，此模型的建立，在病毒学及免疫学指标上，对SARS相关冠状病毒的包括病原学、免疫学、发病机理的研究，以及药物筛选、疫苗评价等应用方面有着不可替代作用，在SARS相关冠状病毒选择敏感感染动物研究方面有代表性的意义。本专利技术的另一方面，涉及一种构建SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹猴感染模型的方法。在本专利技术的一个具体实施方案中，对待感染的中国恒河猴及食蟹猴采用经鼻腔滴鼻接种的方式，病毒接种量为0.5-1ml107半数组织细胞病变剂量(TCID50)。在本专利技术的又一实施方案中，对待感染的中国恒河猴及食蟹猴采用经气管内注射病毒的接种方式，病毒接种量为0.5-1ml106TCID50。在本专利技术的又一实施方案中，对待感染的中国恒河猴及食蟹猴采用静脉注射病毒的方式，接种量为0.5-1ml105TCID50。事实上，也可以选择上述三种接种病毒方式的任意组合对所述动物进行接种。由上述方法感染的本专利技术所述动物在接种后第3-5天出现发热，第5天后RT-PCR检测病毒基因阳性，可持续到20天，期间病毒分离阳性。SARS感染人的途径为接触性感染和气溶胶方式感染，主要以高热和肺部感染症状为主。本实验方法首先通过呼吸道感染，包括滴鼻，气管内注入病毒培养液，也通过静脉注射感染，发现通过静脉注射感染病毒量较少也能成功感染两种猴，同时以同样方法感染绒猴，未获成功。表明非人灵长类对SARS相关冠状病毒敏感性不同。本专利技术的又一方面，涉及SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹猴感染模型用于SARS相关冠状病毒体内感染过程、发病机理、机体抵抗作用研究的用途。SARS疾病目前留有许多问题未能解决，包括感染的靶器官、靶组织和靶细胞，对免疫系统的攻击，免疫系统细胞的反应等，在人体内无法取材，而在模型猴中可开展时间动力学任何指标的取材、示踪以及相关条件病原协同致病的研究中的用途。本专利技术的又一方面，涉及SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹猴感染模型用于抗SARS相关冠状病毒药物筛选和疫苗评价中的用途。恒河猴与食蟹猴感染SARS相关冠状病毒后，均能检测到病毒学和免疫学指标，如在一定时间内产生抗SARS相关冠状病毒IgM和IgG抗体，体液和组织内成功分离病毒，感染后20天内RT-PCR检测病毒阳性，这些病毒学及免疫学指标，对SARS相关冠状病毒药物筛选、疫苗评价等应用方面有着不可替代作用。具体地，所述动物模型能够用于如任何抗SARS病毒药物，包括中药的效果评价中。如果待测药物具有抗SARS相关冠状病毒的作用，则所述药物的效果能通过猴体内改变以上指标而评价药效以及毒副作用。在我国现有实验动物中没有其他动物比实验用猴更接近人类，因而，对疫苗的评价，这种模型具有无可替代的优越性。附图说明图1.恒河猴标本中SARS冠状病毒RNA的套式RT-PCR检测，其中泳道自左向右分别为1#883接种病毒第5天咽拭子；2#900接种病毒第5天咽拭子；3DL2000分子量标志(2000，1000，750，500，250，100bp)；4阴性对照；5阳性对照。图2.恒河猴#883的肺脏活检组织切片，其中上图为获自本专利技术动物模型的肺脏活检组织切片，下图为正常肺脏活检组织切片对照。实施例实施例1SARS病毒毒株的制备SARS毒种由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供，其分离自SARS病人，在Vero-E6细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒，所述病毒已经根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约于2003年6月26日保藏在国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并给予了保藏号为0962，该国际保藏单位的地址是中国北京市海淀区中关村北一条13号。病毒TCID50为106pfu/ml。实施例2动物模型的建立1.病毒接种选择13月龄雌性和雄性中国恒河猴各一只，编号为#900和#883，接种前按实验用猴国家标准微生物SPF级进行复检，并检查SARS病毒抗体。经鼻腔接种实施例1所获得的SARS病毒，病毒接种量为#900猴106TCID50(1ml体积)，#883猴105TCID50(1ml体积)。所有动物实验均按《实验动物所实验动物使用及实验规程》在SARS专用P3动物实验室中进行。2.接种后动物相关临床症状表现两只恒河猴在如前述剂量的病毒接种的第2～3天时，有一过性的体温升高，39℃左右，随后恢复到38℃左右。白细胞亦未见异常改变。无咳嗽、流涕、呕吐、皮疹、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲不振等临床表现。3.接种后动物样本病毒监测在SARS冠状病毒接种恒河猴1天后，每天收集咽拭子、鼻拭子和粪便标本，接种Vero细胞，进行病毒分离，每日观察细胞病变，持续观察10天后盲传，具体方法参见。结果表明持续观察10天后未见细胞病理改变(CPE)出现，盲传2代后，仍未见CPE，盲传3代后，出现细胞病变。4.动物模型中SARS冠状病毒RNA的检测在SARS冠状病毒接种恒河猴1天后，每天收集咽拭子、鼻拭子和粪便标本，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(德国Qiagen公司)，在P3实验室内提取病毒RNA，用对应于SARS冠状病毒1b区的引物进行套式RT-PCR检测。引物序列为外侧引物1#5’-GCTGCATTGGTTTGTTATATCGTTATGC-3’(SEQ ID NO1)，2#5’ATACAGAATACATAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦川，魏强，蒋虹，朱华，高虹，涂新明，
申请(专利权)人：中国医学科学院实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：