本发明专利技术属于生物医学领域，提供确定人肠道病毒７１型（ＥＶ７１）总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，通过分段表达鉴定了人肠道病毒７１型总蛋白，并进行各片断免疫原性和诱导抗体与人体抗原的交叉反应，将人肠道病毒７１型总蛋白的不同片断分为３类：（１）引发人体抗原的强交叉免疫原；（２）引发人体抗原的弱交叉免疫原；（３）与人体抗原不存在交叉免疫原。因此，本发明专利技术将对人肠道病毒７１型疫苗的研制具有指导作用，可以根据本发明专利技术设计与人体无交叉反应或弱交叉反应的手足口病疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，特别是涉及到研究人肠道病毒71型的方法。
技术介绍
人肠道病毒71型(EV71)于1969年首次被分离鉴定，是手足口病的病原体之一。该病毒主要感染5岁以下儿童，主要导致手足口病及疱疹性咽峡炎，少数情况下的并发症包括脑膜炎，肺水肿，出血等，严重病例可导致死亡。人肠道病毒71型曾引起世界范围内的多次疾病暴发流行，上世纪80年代以来，人肠道病毒71型引发的手足口病在亚太地区肆虐，引发了严重的婴幼儿死亡病例。 我国自1981年在上海发现本病，以后各个省市均有报道。2009年3月全国通过传染病网络直报系统报告的手足口病病例是54713例，死亡31例。从今年年初到4月7号，网络直报显示，全国累计报告手足口病例115618例，其中重症773例，死亡50例。 人肠道病毒71型多肽链全长2，193个氨基酸，在体内合成后切割成11个蛋白，包括VP1， VP2， VP3， VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。 目前较为流行的人肠道病毒71型致病机制为，病毒感染人体后，引起血脑屏障渗透性增加，随后病毒在脑内神经元细胞的大量复制和引发的细胞损伤，导致了神经元性肺水肿和肺水肿，这是婴幼儿严重病例及死亡的主要原因。 但是，同时在小鼠体内的比较医学试验表明，新生鼠的发病并没有伴随病毒在脑组织的大量复制，对传统的病毒致病机理认知提出了新的挑战，确定人肠道病毒71型感染的致病机理，是手足口病治疗与预防的重要前提。
技术实现思路
鉴于以上需要，本专利技术的主要目的在于提供。 为了达到以上目的，本专利技术提供的，其主要包括以下步骤 a.人肠道病毒71型总蛋白的分割和工程表达 将人肠道病毒71型多肽链分割成由22 156个氨基酸组成的多肽，共22个，分别在大肠杆菌中表达，使用6XHis tag标签进行纯化； b.人肠道病毒71型总蛋白的分割多肽抗原性的确定 将纯化的蛋白对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应得抗血清，确定了与人体存在强交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定了与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定了与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽。 上述步骤a中，将EV71病毒的多肽链进行顺序分割，将2193个氨基酸从N端依次3分割成22 156个氨基酸构成的多肽，共22个，绝大多数多肽的分子量在10kDa左右； 上述步骤a中，相邻并且同属于一个蛋白的两个多肽之间存在4 19个氨基酸的重叠，避免了抗原决定簇的筛选遗漏； 上述步骤a中，多肽的N端与6XHis tag标签进行融合表达，因为6XHis tag蛋白标签不会对多肽的抗原性产生明显影响，同时有利于多肽的纯化； 上述步骤b中，多肽对实验动物免疫，所述实验动物包括大鼠，小鼠，兔，猴等； 上述步骤b中，P23。—323， P646—755， P857—皿2， P1329—144。 4种多肽与人体抗原的交叉反应结果为强阳性，下标数字表示在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP2， VP1，2A，2C蛋白;P卜69， P324-443， P444-565， P566-665， P 46-876， Pl441-1526，Pl549-1668， Pl732-1851， Pl952-2071， P2072-2193IO种多肽与人体抗原的交叉反应结果为弱阳性，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP4， VP3， VP1，3A，3C以及3D蛋白；P7。—159， P14。—249， P1197—1338，P1649-1731 ， P1843-19515种多肽与人体抗原不存在交叉反应，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP2，2C，3C以及3D蛋白。 综上所述可以得知，EV71抗血清与人体抗原存在交叉免疫反应，并且确定了 EV71总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域，据此将人肠道病毒71型总蛋白的不同片断分为3类(1)引发人体抗原的强交叉免疫原；(2)引发人体抗原的弱交叉免疫原；(3)与人体抗原不存在交叉免疫原。因此，本专利技术将对人肠道病毒71型疫苗的研制具有指导作用，可以根据本专利技术设计与人体无交叉反应或弱交叉反应的手足口病疫苗，其中，人肠道病毒71型总蛋白中与人体抗原不存在交叉免疫原的区域可以用来设计疫苗，制备与人体无交叉反应的手足口病疫苗。人肠道病毒71型总蛋白中与人体抗原存在弱交叉免疫原的区域可以用来设计疫苗，制备与人体弱交叉反应的手足口病疫苗。具体实施例方式以下结合具体实施方案对本专利技术作进一步详细说明，但不作对其的限定 实施步骤一 人肠道病毒71型总蛋白的分割和工程表达 分割所依赖的模板为中国安徽省阜阳的人肠道病毒71型分离株，Genbank存储号为EU703812。该菌株的基因组CDS区共6582bp，编码2193个氨基酸，分割多肽的大小控制在100个氨基酸(aa)左右，下限为22aa，上限为156aa，位于同一个蛋白内的相邻两个多肽间存在4 15aa的重叠，如表1。 表1人肠道病毒71型总蛋白的分割方式多肽名称所属蛋白多肽编码区在人肠道病毒71型 基因组编码区中的位置Pl-69VP41-207P70-159VP2208-477P"0-249VP2418-747P230-323VP2688-969P324-443VP3970-1329P444-565VP31330-1695P566-665VP11696-1995P646-755VP11936-2265P 46-876VP12236-2628P857-10122A2569-3036P013-lll2B3037-3333Pl112-12012C3334-3603 ，Pll97-13382C3589-4014Pi 329-14402C3985-4320P441-15263A4321-4578Pl527-15483B4579-4644Pl549-16683C4645-5004P聽-17313C4945:5193P1732-18513D5194-5553P鹏-19513D5527-5853Pi 952-20713D5854-6213P2072-21933D6214-6582 扩增多肽编码区的引物两端添加Ndel和Sacl位点，表达载体使用改造过的pET28a(+)表达载体，该载体经过修改后，所表达目的蛋白的N端除6XHis tag蛋白标签外，不含有多余的氨基酸序列。 构建成功的表达载体转入Escherichia coli BL21(DE3)中，用O. 5mM IPTG诱导多肽表达。多肽表达用SDS-PAGE检测，结果显示除P肌Hm，PmH训，P！527—1548三个多肽表达失败外，其余多肽皆成功表达。 实施步骤二 分割多肽的纯化 多肽以不可溶的包涵体形式表达，纯化的包涵体使用8M尿素溶解，随后使用 Novagen公司的Ni-HTA进行亲和层析纯化，纯化后多肽纯度达到95%以上。 实施步骤三 确定与人体抗原存在交叉免疫原的多肽 纯化后的多肽对ICR小鼠免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织 进行免疫组化试验，确定人体抗原的交叉免疫原。 抗血清稀释倍数为1 : 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
确定人肠道病毒７１型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，主要包括以下步骤： ａ．人肠道病毒７１型总蛋白的分割和工程表达 将人肠道病毒７１型多肽链从Ｎ端依次顺序分割成由２２～１５６个氨基酸组成的多肽，共２２个，分别在大肠杆菌中表达，使用６×Ｈｉｓ ｔａｇ标签进行纯化； ｂ．人肠道病毒７１型总蛋白的分割多肽抗原性的确定 将纯化的多肽对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应的抗血清，确定了与人体存在强交叉免疫原区域的人肠道病毒７１型多肽；确定了与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病毒７１型多肽；确定了与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒７１型多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦川，刘江宁，张连峰，李万波，
申请(专利权)人：中国医学科学院实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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