用于创伤弧菌检测的RAA引物组、crRNA序列及RAA-CRISPR方法技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于创伤弧菌检测的RAA引物组、特异性crRNA、试剂盒及检测方法。本发明专利技术设计并筛选了创伤弧菌RAA的扩增引物以及crRNA序列，提出了基于RAA‑CRISPR系统构建一种新型创伤弧菌检测方法，可以实现对创伤弧菌的简便、快速、准确检测。

【技术实现步骤摘要】
用于创伤弧菌检测的RAA引物组、crRNA序列及RAA-CRISPR方法
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于创伤弧菌检测的RAA引物组、特异性crRNA、试剂盒及检测方法。
技术介绍
创伤弧菌是一类革兰氏阴性人畜共患致病菌，能在牡蛎、对虾等水产品内大量繁殖，对相关养殖产业造成沉重经济损失的同时也严重影响养殖人员、消费者等人身安全。创伤弧菌也是一种病死率较高的致病菌，因食源性感染导致的病死率高达50%，而由伤口感染导致的病死率也有25%左右。临床病例研究发现，发病后及时给予治疗将显著降低患者病死率。然而，及时治疗的关键，是快速、准确的检测。此外，为便于在床旁、户外以及资源匮乏地区进行检测，简单、便携的方法备受青睐。因此，开发一种简便、快速、准确的创伤弧菌检测方法具有重要的现实意义。目前，用于创伤弧菌检测的方法为qRT-PCR，但该方法需要专业仪器和熟练操作人员，限制了其在户外和资源匮乏地区的应用。随着核酸扩增技术的发展，无需专业仪器、耗时短、在恒温条件下即可进行的重组酶介导等温核酸扩增技术（RAA）应运而生，有望用于即时检测。然而，这种技术也存在一定局限性，扩增产物常需纯化、电泳分析以判定检测结果，加重了气溶胶污染问题，提高了假阳性风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于创伤弧菌检测的RAA引物组、特异性crRNA、试剂盒及检测方法。本专利技术所采取的技术方案如下：用于创伤弧菌检测的RAA引物组，其为RAA-F1和RAA-R1构成的引物对或RAA-F2和RAA-R2构成的引物对；RAA-F1的序列如SEQIDNO.1所示；RAA-R1的序列如SEQIDNO.2所示；RAA-F2的序列如SEQIDNO.3所示；RAA-R2的序列如SEQIDNO.4所示。其为RAA-F2和RAA-R2构成的引物对。一种用于创伤弧菌检测的特异性crRNA，其为crRNA1、crRNA2、crRNA3、crRNA4中的一种或多种；crRNA1的序列如SEQIDNO.5所示；crRNA2的序列如SEQIDNO.6所示；crRNA3的序列如SEQIDNO.7所示；crRNA4的序列如SEQIDNO.8所示。其为crRNA3和crRNA4的混合。一种用于创伤弧菌检测的试剂盒，包括RAA引物组、特异性crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针；其中RAA引物组为RAA-F1和RAA-R1构成的引物对或RAA-F2和RAA-R2构成的引物对；RAA-F1的序列如SEQIDNO.1所示；RAA-R1的序列如SEQIDNO.2所示；RAA-F2的序列如SEQIDNO.3所示；RAA-R2的序列如SEQIDNO.4所示；特异性crRNA为crRNA1、crRNA2、crRNA3、crRNA4中的一种或多种；crRNA1的序列如SEQIDNO.5所示；crRNA2的序列如SEQIDNO.6所示；crRNA3的序列如SEQIDNO.7所示；crRNA4的序列如SEQIDNO.8所示。其中RAA引物组为RAA-F2和RAA-R2构成的引物对；特异性crRNA为crRNA3和crRNA4的混合。所述荧光探针为5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1。一种创伤弧菌检测方法，其采用如上所述的用于创伤弧菌检测的试剂盒，其包括以下步骤：（1）对被测试样进行基因组提取，得到待测基因组样品；（2）采用RAA引物组对待测基因组样品扩增；（3）将Cas12a蛋白和crRNA，合并于一管，振荡离心后孵育形成核糖核蛋白体，将步骤（2）的产物和荧光探针加入到创伤弧菌检测检测体系中，振荡离心后，切割反应；（4）检测体系的荧光强度。步骤（2）中RAA引物组与待测基因组样品扩增反应的时间为15-30min。步骤（3）中，切割反应为15-30min。本专利技术的有益效果如下：本专利技术设计并筛选了创伤弧菌RAA的扩增引物以及crRNA序列，提出了基于RAA-CRISPR系统构建一种新型创伤弧菌检测方法，可以实现对创伤弧菌的简便、快速、准确检测。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本专利技术的范畴。图1为实施例1中crRNA筛选结果；图2为实施例1中灵敏度评价结果，上图为酶标仪测定结果，下图为UV手电筒照射结果；图3为实施例1中特异性评价结果；图4为实施例2中盲检结果；图5为实施例2的检测的流程图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。实施例1：通过对已公布的创伤弧菌vvhA序列比对分析，结合RAA引物设计原则，设计出2对高特异性、高扩增效率的RAA引物（表1）。(1)RAA反应本项目使用的RAA试剂盒为江苏奇天基因生物科技有限公司的核酸扩增试剂盒（B00000），具体步骤如下：1）检测开始前30min启动水浴锅，温度设置为37℃；2）从铝箔包装中取出当次实验需要的反应管，放到96孔板上，并取出缓冲液V、纯水、RAA引物和模板置于冰上备用；3）每个反应管中依次加入17.5μL纯水、2μL引物F（10μM）、2μL引物R（μM）和25μL缓冲液V，轻弹反应管使冻干粉充分重溶，并短暂离心后放置冰上；4）打开反应管，向每个反应管中加入2.5μL乙酸镁和1μL模板。切记在加入模板时要将枪头插至液面以下，以防气溶胶污染。另外，每完成一个样品，立马盖紧管盖，再进行下一个反应管加样。加样完成后，振荡混匀；5）将反应管放置水浴锅中，孵育40min；6）后续若进行电泳分析，则将RAA反应产物与酚/氯仿1:1混匀，12000g离心15min。吸取上清，进行电泳分析。(2)crRNA设计从RAA扩增子序列中查找含有TTTN或AAAN的保守区域，并且对应的下游或上游20nt区域亦为保守区域。该20nt区域即为crRNA的特异性序列（T变为U），再加上Cas12a的scaffold序列（UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU），即为一条完整的crRNA序列。针对1号和2号扩增子（查找发现每个扩增子中只有2个有效PAM序列）设计4对crRNA（1号：CR1和CR2；2号：CR3和CR4），序列见表2。(3)探针合成本项目使用的探针为5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1，基此构建的RAA-CRISPR/Cas12a方法可使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 用于创伤弧菌检测的RAA引物组，其特征在于：其为RAA-F1和RAA- R1构成的引物对或RAA-F2和RAA-R2构成的引物对；/nRAA-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；/nRAA- R1的序列如SEQ ID NO.2所示；/nRAA-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；/nRAA-R2的序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于创伤弧菌检测的RAA引物组，其特征在于：其为RAA-F1和RAA-R1构成的引物对或RAA-F2和RAA-R2构成的引物对；
RAA-F1的序列如SEQIDNO.1所示；
RAA-R1的序列如SEQIDNO.2所示；
RAA-F2的序列如SEQIDNO.3所示；
RAA-R2的序列如SEQIDNO.4所示。


2.根据权利要求1所述的用于创伤弧菌检测的RAA引物组，其特征在于：其为RAA-F2和RAA-R2构成的引物对。


3.一种用于创伤弧菌检测的特异性crRNA，其特征在于：其为crRNA1、crRNA2、crRNA3、crRNA4中的一种或多种；
crRNA1的序列如SEQIDNO.5所示；
crRNA2的序列如SEQIDNO.6所示；
crRNA3的序列如SEQIDNO.7所示；
crRNA4的序列如SEQIDNO.8所示。


4.根据权利要求3所述的用于创伤弧菌检测的特异性crRNA，其特征在于：其为crRNA3和crRNA4的混合。


5.一种用于创伤弧菌检测的试剂盒，其特征在于：包括RAA引物组、特异性crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针；
其中RAA引物组为RAA-F1和RAA-R1构成的引物对或RAA-F2和RAA-R2构成的引物对；
RAA-F1的序列如SEQIDNO.1所示；
RAA-R1的序列如SEQIDNO.2所示；
RAA-F2的序列如SEQIDNO.3所示；
RAA-R2的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖星星，郑来宝，林子琴，楼永良，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33