一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒及检测方法，水产品体内镉含量与对应水产品肠道微生物Methylobacterium含量呈正相关，通过该试剂盒测定水产品肠道微生物Methylobacterium含量，进而定量测定水产品体内镉含量，具体公开了该试剂盒所包含的试剂及其含量，同时具体公开了该试剂盒的具体检测过程。本发明专利技术可以用来定量测定水产品中镉含量。该方法相较于其他方法有点在于前期操作简单、对仪器要求不高、时间较快等。因此，该方法可以用于快速检测水产品中镉含量。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒及检测方法
本专利技术属于荧光实时定量PCR扩增检测试剂盒
，具体涉及一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒及检测方法。
技术介绍
镉(Cadmium，Cd)是一类典型的有毒重金属，也是引起“骨痛病”的罪魁祸首。研究表明，持续进食少量的镉可引发严重的中毒症状，而长期接触可致癌。由于工业化快速发展、农业活动和其他地质和环境变化，大量的镉随废水及地表径流进入水生生态环境，造成水生生物圈的污染。目前，水体中镉污染造成的影响是全世界范围的。另外，原料以及加工过程造成的饲料镉污染状况也不可忽视。水体和饲料中镉污染对水产动物多种器官带来毒性损伤，从而影响其繁殖、生长、发育，诱导水产动物发生病害，严重时可导致其大量死亡，这给水产养殖业及其所带动的产业链造成了重大损失。同时，镉污染还会导致水产品体内镉含量增加甚至超标，人类进食受污染的水产品后会对自身健康带来损害。因此，水产品中镉污染问题一直是人们关注的焦点。了解水产品镉污染现状及膳食风险并进行水产品质量安全评估非常必要。目前，水产品中镉含量常用的检测方法主要有石墨炉原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法。然而，这两种方法对于样品前处理过程繁琐复杂，并且这两种检测方法需要高精密仪器测定，比如石墨炉原子吸收光谱法需要原子吸收光谱仪(120万)，电感耦合等离子体质谱法需要飞行时间质谱(300万)。因此，这两种方法在基层或者市场水产品镉含量检测中很难广泛应用。另外，上述两种方法在测定水产品中镉含量时存在不确定性。采用电感耦合等离子体质谱法不确定性主要来源于标准溶液的配制、测量重复性不好、标准曲线拟合度不高。原子吸收光谱仪法不确定性主要来源于样品重量、样品回收率、仪器稳定性等。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种操作简单、成本低廉且对仪器要求不高的快速检测水产品体内镉含量的试剂盒及检测方法。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒，其特征在于：水产品体内镉含量与对应水产品肠道微生物Methylobacterium含量呈正相关，通过该试剂盒测定水产品肠道微生物Methylobacterium含量，进而定量测定水产品体内镉含量，该试剂盒所包含的试剂及其含量如下：PBS溶液，500mL，单次反应量5mL；SDS裂解液，200mL，单次反应量2mL；氯仿，50mL，单次反应量0.5mL；异丙醇，100mL，单次反应量1.0mL；无水乙醇，100mL，单次反应量1mL；DNaseFreeddH2O，300mL；2×SYBRGreenMix，15mL，单次反应量25μL，该2×SYBRGreenMix包括以下成分：SYBRGreenRT-PCR缓冲液：TrisCl，KCl，(NH4)2SO4，5mMMgCl2，PH8.7；dNTP；染料：SYBRGreenΙ和ROX和PCR酶：DNAPolymerase；10μM特异性上游引物I，150μL，单次反应量1.0μL，该特异性上游引物I序列为：GGCAGGGGTTTTGTG；10μM特异性下游引物II，150μL，单次反应量1.0μL，该特异性下游引物II序列为：CTCTGGCCGGTTCAT。本专利技术所述的快速检测水产品体内镉含量的试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：水产品肠道微生物DNA提取1)解剖水产品，取水产品肠道内容物0.5g，滴加PBS溶液5mL，混匀；2)向试管中加入SDS裂解液，混匀，37℃水浴10min，室温12000r/min离心10min，保留上清液；3)向上清液中加入等体积的氯仿，颠倒混匀10分钟，室温12000r/min离心10min，保留上清液；4)向上清液中加入1/10体积的异丙醇，混匀，4℃、2000r/min离心10min，保留沉淀；5)向沉淀中加入1mL无水乙醇，混匀，4℃、2000r/min离心10min，保留沉淀；6)将沉淀溶于100μLDNaseFreeddH2O中；步骤S2：实时定量PCR检测水产品体内Methylobacterium特异性基因与内参基因16s1)采用50μL反应体系，每个样品设置3个复孔，以保证结果的可靠性，反应体系：操作时，保证所有试剂都在冰上操作，按照上述反应体系用移液枪将PCR反应液加入到PCR管中，封盖后瞬时离心，放入荧光定量PCR仪中进行扩增；2)程序设定如下：其中，从步骤3至步骤5持续40个循环；3)测得样品Methylobacterium与内参基因16s扩增的CT值，并采用2-ΔΔCT法，计算HDAC5的相对含量，通过该试剂盒测定水产品肠道微生物Methylobacterium含量，进而定量测定水产品体内镉含量。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术通过不同浓度镉暴露处理鲤鱼，发现其体内肠道微生物Methylobacterium的含量随着暴露浓度的增加而增加。推测水产品肠道微生物Methylobacterium的含量可以作为评估水产品镉含量的指标。本专利技术制备了一种检测水产品肠道微生物Methylobacterium含量的试剂盒。经过后期验证，发现鲤鱼体内镉含量与肠道Methylobacterium含量呈正相关。表明该试剂盒可以用来定量测定水产品中镉含量。该方法相较于其他方法有点在于前期操作简单、对仪器要求不高、时间较快(3小时)等。因此，该方法可以用于快速检测水产品中镉含量。附图说明图1是镉暴露对鲤鱼肠道微生物组成的影响；图2是镉暴露对鲤鱼肠道微生物多样性的影响；图3是鲤鱼体内镉含量与肠道微生物Methylobacterium含量正相关曲线。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例发现：经过镉暴露后鲤鱼体内镉含量和其肠道微生物Methylobacterium(一种耐镉微生物)的含量呈正相关。同时，未经各暴露处理的鲤鱼体内该微生物的含量很低或者没有。因此，该微生物可以用评估水产品镉含量水平。验证：通过制备微生物Methylobacterium含量检测试剂盒，利用不同浓度的镉暴露处理鲤鱼，一个月后分别用石墨炉原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法检测鲤鱼体内镉含量。并用制备试剂盒测定了鲤鱼肠道中Methylobacterium。发现镉暴露浓度越高，体内Methylobacterium含量越高，并且存在线性关系。证实，制备的微生物Methylobacterium含量检测试剂盒可以用来快速检测水产品体内镉含量。本专利技术的具体研究内容及技术方案如下：本专利技术申请人前期研究不同浓度的镉含量(0、0.5、1.0、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒，其特征在于：水产品体内镉含量与对应水产品肠道微生物Methylobacterium含量呈正相关，通过该试剂盒测定水产品肠道微生物Methylobacterium含量，进而定量测定水产品体内镉含量，该试剂盒所包含的试剂及其含量如下：/nPBS溶液，500mL，单次反应量5mL；/nSDS裂解液，200mL，单次反应量2mL；/n氯仿，50mL，单次反应量0.5mL；/n异丙醇，100mL，单次反应量1.0mL；/n无水乙醇，100mL，单次反应量1mL；/nDNase Free ddH

【技术特征摘要】
1.一种快速检测水产品体内镉含量的试剂盒，其特征在于：水产品体内镉含量与对应水产品肠道微生物Methylobacterium含量呈正相关，通过该试剂盒测定水产品肠道微生物Methylobacterium含量，进而定量测定水产品体内镉含量，该试剂盒所包含的试剂及其含量如下：
PBS溶液，500mL，单次反应量5mL；
SDS裂解液，200mL，单次反应量2mL；
氯仿，50mL，单次反应量0.5mL；
异丙醇，100mL，单次反应量1.0mL；
无水乙醇，100mL，单次反应量1mL；
DNaseFreeddH2O，300mL；
2×SYBRGreenMix，15mL，单次反应量25μL，该2×SYBRGreenMix包括以下成分：SYBRGreenRT-PCR缓冲液：TrisCl，KCl，(NH4)2SO4，5mMMgCl2，PH8.7；dNTP；染料：SYBRGreenΙ和ROX和PCR酶：DNAPolymerase；
10μM特异性上游引物I，150μL，单次反应量1.0μL，该特异性上游引物I序列为：
GGCAGGGGTTTTGTG；
10μM特异性下游引物II，150μL，单次反应量1.0μL，该特异性下游引物II序列为：
CTCTGGCCGGTTCAT。


2.一种权利要求1所述的快速检测水产品体内镉含量的试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：水...

【专利技术属性】
技术研发人员：常绪路，康美如，张建新，冯军厂，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41