一种基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于BCA‑RPA和CRISPR‑Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，特点是包括以下步骤：将纳米磁珠探针溶液和AuNPs探针溶液同时加入到含鼠伤寒沙门氏菌的待测溶液中，于室温下震荡反应45分钟后，磁分离洗涤3次后，复溶于无酶水中，即得到MNB探针‑细菌‑AuNPs探针三明治结构，将MNB探针‑细菌‑AuNPs探针三明治结构进行RPA扩增反应，在37℃反应5分钟，反应结束后，在蓝光下观察荧光进行肉眼检测或者用酶标仪定量检测，根据鼠伤寒沙门氏菌不同浓度下对应的荧光强度值得到的曲线，得到待测溶液中鼠伤寒沙门氏菌浓度值，优点是简便快速、灵敏度高以及可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法
本专利技术涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，尤其是涉及一种基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。
技术介绍
鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）是引起食源性疾病的主要原因之一，已经对人类健康造成了巨大的威胁。食用鼠伤寒沙门氏菌感染的食物可能会导致呕吐、腹泻、甚至死亡。在中国，约有80%的食源性致病菌疾病爆发是由鼠伤寒沙门氏菌引起的。因此，建立灵敏、快速的鼠伤寒沙门氏菌鉴定方法对有效保障食品行业和个人的食品安全至关重要。现有的用于检测食源性致病菌的各种方法如：常规培养法、酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应（PCR）等。常规培养法仍是国际上可靠的“金标准”方法，但其耗费人力、时间，不能满足快速检测的需求。此外，ELISA因其特异性好、通量高而被广泛应用于细菌检测，但其灵敏度不高（104-105CFU/mL）。相比之下，PCR更为灵敏，但其需要昂贵的仪器和受过专业培训的技术人员，这不利于现场检测应用。因此，迫切需要一种灵敏、简便、快速的食源性致病菌现场检测方法。最近，CRISPR-Cas12a系统被证明在识别特定的目标DNA后具有无差别切割单链DNA的活性。CRISPR-Cas12a系统与目标DNA结合后被激活，可以实现每秒1250次的催化速度，催化效率接近扩散速率。CRISPR-Cas12a系统这种高效的无差别切割活性被用于切割外源性导入、自猝灭的DNA荧光报告基因，以灵敏地检测相关的靶标DNA。为了进一步提高灵敏度，将核酸扩增技术如PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）和重组酶聚合酶扩增技术（RPA）应用于CRISPR-Cas12a系统的生物传感器。例如，许多基于CRISPR-Cas12a系统结合RPA的方法已经被建立，可以高灵敏度地检测食源性致病菌，甚至在单细菌水平。然而，这些基于CRISPR-Cas12a系统的超灵敏方法都需要昂贵的仪器（如荧光分光光度计）来读出荧光值，这限制了它们在实际应用中的广泛使用，特别是在野外和一些不发达地区。可视化检测（可以通过肉眼看到并直接识别结果）在现场检测中具有很大的潜力，因为其不需要复杂和昂贵的仪器。目前已经开发出了一些基于CRISPR-Cas12a系统的可视化细菌检测方法。例如，张等人将PCR技术和CRISPR-Cas12a系统结合，开发出了一种用于对虾样品中副溶血性弧菌的可视化检测方法。虽然其自制的低成本紫外设备可以直接读出荧光信号，但其灵敏度较低（1.02×105CFU/mL），限制了其在鉴别早期病原菌污染的应用。除了荧光信号输出，最近还报道了一种将CRISPR-Cas12a系统和横向流动试纸条法结合的比色法用于检测细菌。该方法的检出限改进到10aMDNA（6×103CFU/mL），但对“零忍受”的病原菌来说，仍不够灵敏。因此，需要一种更有效的信号放大策略来进一步提高基于CRISPR-Cas12a的可视化检测方法的灵敏度。生物条形码检测技术（BCA）是一种优良的信号扩增策略，兼具PCR技术的灵敏度和ELISA的特异性。在这个策略中，条形码纳米金（AuNPs）探针同时修饰有高密度的条形码DNA以及抗体，分别用于放大信号和识别目标。由于条形码DNA，其易于和不同的核酸扩增技术结合实现第二轮信号放大，而抗体赋予其高特异性和多功能性。因此，许多生物条形码检测方法被开发用于快速检测食品中的生物和化学污染，且BCA的检测限比常规ELISA试剂盒低1000倍。然而，BCA通常需要从AuNPs探针表面释放条形码DNA的复杂步骤，这使得过程复杂化，并可能导致条形码DNA的损失，进而降低灵敏度。目前，国内外还没有公开关于生物条形码检测技术结合重组酶聚合酶扩增技术和CRISPR-Cas12a系统可视化检测鼠伤寒沙门氏菌的方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简便快速、灵敏度高以及可视化检测的基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，包括以下步骤：（1）AuNPs探针的合成A.将100mL1mMHAuCl4水溶液磁力搅拌加热至沸腾后，加入10mL38.8mM的柠檬酸三钠水溶液，待溶液由淡黄色变成酒红色停止加热，并继续磁力搅拌15分钟后，得到AuNPs溶液；B.将AuNPs溶液用Na2CO3溶液调节pH为7.4后，加入10μL1mg/mL的抗鼠伤寒的单克隆抗体溶液，并加入连接DNA至其终浓度为3μM，在-80℃下反应15钟，于9000rpm，4℃温度下离心15分钟去除上清液，将沉淀分散在1mL0.01M的pH为7.4的磷酸盐缓冲液中后，加入条形码DNA至其终浓度为3μM，在-80℃下反应15分钟后，用终浓度为2wt%的牛血清蛋白溶液于37℃封闭1小时后，再于9000rpm离心15分钟，磷酸盐缓冲液洗3次去除上清液，将沉淀分散在1mL磷酸盐缓冲液中，即得到AuNPs探针溶液；（2）纳米磁珠（MNB）探针的制备将1mg/mL链酶亲和素化的纳米磁珠溶液和0.5mg/mL的生物素化沙门氏菌单克隆抗体（bio-mAb）溶液等体积混合后，于室温下震荡反应30分钟后，加入D-生物素至其终浓度为2μM，于室温下再震荡封闭30分钟，用含0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液磁分离洗涤2次，复溶于与纳米磁珠溶液等体积的磷酸盐缓冲液中，即得到纳米磁珠探针溶液；（3）鼠伤寒沙门氏菌的检测将步骤（2）制备得到的纳米磁珠探针溶液和步骤（1）制备得到的AuNPs探针溶液同时加入到含鼠伤寒沙门氏菌的待测溶液中，于室温下震荡反应45分钟后，磁分离洗涤3次后，复溶于无酶水中，即得到MNB探针-细菌-AuNPs探针三明治结构，将MNB探针-细菌-AuNPs探针三明治结构进行RPA扩增反应，在37℃反应5分钟，反应结束后，在蓝光下观察荧光进行肉眼检测或者用酶标仪定量检测，根据鼠伤寒沙门氏菌不同浓度下对应的荧光强度值得到的曲线，得到待测溶液中鼠伤寒沙门氏菌浓度值。优选的，步骤（1）中所述的连接DNA的序列为：5'-ACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGT-C6-SH-3'；所述的条形码DNA的序列为：5'-ACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGTTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTA-3'。优选的，步骤（3）中所述的纳米磁珠探针溶液、所述的AuNPs探针溶液、所述的待测溶液和所述的无酶水的体积比为3μL：20μL：200μL：3μL。优选的，步骤（3）中所述的RPA扩增反应体系为：14.75μL再水化缓冲液（rehydrationbuffer），六分之一管RPA酶冻干粉，0.5μL10µM上游引物，0.5μL10µM下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：/n（1）AuNPs 探针的合成/nA.将100 mL 1 mM HAuCl

【技术特征摘要】
1.一种基于BCA-RPA和CRISPR-Cas12a系统检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）AuNPs探针的合成
A.将100mL1mMHAuCl4水溶液磁力搅拌加热至沸腾后，加入10mL38.8mM的柠檬酸三钠水溶液，待溶液由淡黄色变成酒红色停止加热，并继续磁力搅拌15分钟后，得到AuNPs溶液；
B.将AuNPs溶液用Na2CO3溶液调节pH为7.4后，加入10μL1mg/mL的抗鼠伤寒的单克隆抗体溶液，并加入连接DNA至其终浓度为3μM，在-80℃下反应15钟，于9000rpm，4℃温度下离心15分钟去除上清液，将沉淀分散在1mL0.01M的pH为7.4的磷酸盐缓冲液中后，加入条形码DNA至其终浓度为3μM，在-80℃下反应15分钟后，用终浓度为2wt%的牛血清蛋白溶液于37℃封闭1小时后，再于9000rpm离心15分钟，磷酸盐缓冲液洗3次去除上清液，将沉淀分散在1mL磷酸盐缓冲液中，即得到AuNPs探针溶液；
（2）纳米磁珠探针的制备
将1mg/mL链酶亲和素化的纳米磁珠溶液和0.5mg/mL的生物素化沙门氏菌单克隆抗体溶液等体积混合后，于室温下震荡反应30分钟后，加入D-生物素至其终浓度为2μM，于室温下再震荡封闭30分钟，用含0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液磁分离洗涤2次，复溶于与纳米磁珠溶液等体积的磷酸盐缓冲液中，即得到纳米磁珠探针溶液；
（3）鼠伤寒沙门氏菌的检测
将步骤（2）制备得到的纳米磁珠探针溶液和步骤（1）制备得到的AuNPs探针溶液同时加入到含鼠伤寒沙门氏菌的待测溶液中，于室温下震荡反应45分钟后，磁分离洗涤3次后，复溶于无酶水中，即得到MNB探针-细菌-AuNPs探针三明治结构，将MNB探针-细菌-AuNPs探针三明治结构进行RPA扩增反应，在37℃反应5分钟，反应结束后，在蓝光下观察荧光进行肉眼检测或者用酶标仪定量检测，根据鼠伤寒沙门氏菌不同浓度下对应的荧光强度值得到的曲线，得到待测溶液中鼠伤寒沙门氏菌浓度值。


2.根据权利要求1所述的一种基于BCA-RPA和CR...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔朝晖，蔡琪琦，孙梦妮，马娜，张进杰，杨文鸽，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33