一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法技术

本发明专利技术属于生物发酵工程技术领域，公开了一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法。所述方法包括如下制备步骤：将暗褐网柄牛肝菌固体菌种接种至母种培养基中培养获取母种菌液，然后将获得的母种菌液接种至发酵培养基中，同时添加生物合成EGT的前体物质进行发酵培养，得到菌丝发酵液，最后将所得菌丝发酵液采用乙醇溶液超声浸提，过滤得到含有EGT的提取液。本发明专利技术通过对发酵培养基中的碳源、氮源、生长因子、无机盐等成分进行优化，显著提高了发酵液中EGT的产量，并通过乙醇超声提取法，可快速简便有效的提取菌丝体中的EGT。

【技术实现步骤摘要】
一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法
本专利技术属于生物发酵工程
，具体涉及一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法。
技术介绍
EGT(Ergothioneine)是一种天然的硫咪唑氨基酸(thiol-imidazoleaminoacids)类抗氧化剂，通过清除羟自由基、次氯酸盐、过氧亚硝酸盐以及螯合氧化还原活性阳离子，参与维持活细胞内的氧化还原态。大量研究表明，EGT具有预防和治疗由机体氧化胁迫而引起的癌症、心血管疾病、认知功能障碍等慢性疾病的潜力。此外，EGT通过抗氧化作用抑制肉类、海鲜和水果等食品的氧化与褐变，延长食品的货架期。它具有以下几个特点：(1)强抗氧化性：相比于谷胱甘肽(GSH)、尿酸(uricacid)和Trolox等传统抗氧化剂，EGT具有更强的自由基清除能力。(2)稳定性：由于EGT特殊的构型，它的氧化还原电位(Eo＝-0.06V)比GSH高(Eo＝-0.24V)；因而它具有极高的稳定性，不易发生自氧化。(3)安全性：EGT在人体受试者中持续一周给药高达25mg/天未发现不良反应；在动物模型中，按每公斤给药1600mg，也未表现出任何的不良影响和组织病理学变化。成人和儿童每天用量分别为30mg和20mg均没有观察到遗传毒性。此外，2017年，欧盟发布了EGT作为新食品的安全声明，计算了(按个体体重)以下人群的建议日摄入量：2.82mg/kg/天(婴儿)、3.39mg/kg/天(幼儿)、1.31mg/kg/天(普通成人，妊娠及哺乳期妇女)。因EGT独特的生物学和药理特性以及安全、稳定等优点，在化妆品、功能食品、医疗、治疗学和生物医学等领域展现出良好的应用前景。目前，EGT的制备方法有三种：化学合成法、提取法以及生物合成法。化学方法合成左旋L-EGT十分困难，且存在产品安全性难以保证、合成原料及成本高昂等缺点；生物提取法因生物体内的EGT含量一般较低，提取成本高；生物合成法是目前生产EGT的主要方式，其利用蘑菇中EGT含量高的特点，采用液体发酵技术制备EGT；比如专利文献(CN103184246A)提及利用香菇菌丝发酵后获得发酵液中的EGT含量为23.6mg/L；专利文献(CN103184246A)提到花脸香菇、肺形侧耳以及野生紫孢侧耳等真菌的菌丝发酵液中EGT最高含量分别为51mg/L、48mg/L、37mg/L；专利文献(CN201210392417.8)提到利用糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)深层发酵后，发酵液中的EGT最高含量可达140mg/L；专利文献(CN201811605003.2)也提到利用猴头菌发酵获得EGT，但发酵液中的EGT含量最高也只有240mg/L。此外，专利文献(CN201811605003.2)中提及使用酶解法提取真菌菌丝体EGT的方法，存在提取过程复杂，且成本高昂，不适宜用于大规模提取和检测蘑菇类真菌发酵液中的EGT含量。综上所述，目前利用蘑菇类真菌深层发酵制备EGT方法主要存在以下问题：(1)EGT产量低，导致EGT生产成本偏高，不利于EGT的推广和利用；(2)从菌丝体中提取EGT多采用搅拌加热、酶解等方法，普遍存在菌丝体细胞破碎不完全、操作繁琐、提取成本高。
技术实现思路
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法，包括如下步骤：(1)将暗褐网柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)固体菌种接种至母种培养基中培养获取母种菌液；(2)将获得的母种菌液接种至发酵培养基中，同时添加生物合成EGT的前体物质进行发酵培养，得到菌丝发酵液；(3)将步骤(2)所得菌丝发酵液采用乙醇溶液超声浸提，过滤得到含有EGT的提取液。进一步地，步骤(1)中所述母种培养基包括以下组分：0.5～8％(w/v)果糖、0.5～2％(w/v)玉米干粉、0.5～2％(w/v)酵母粉、、0.02～0.2％(w/v)KH2PO4、0.01～0.1％(w/v)MgSO4、0.01～0.1％(w/v)CaCl2、pH4.0～6.0。进一步地，步骤(1)中所述母种培养基中培养条件为：在18～35℃、90～250rpm振荡条件下，培养6～11天。进一步地，步骤(2)中所述发酵培养基包括以下组分：1～10％(w/v)碳源、0.1～5％(w/v)氮源、0.01～2％(w/v)无机盐、0.001～0.5％(w/v)微量元素、0.001～0.01％(w/v)生长因子、pH4.0～6.0。进一步地，步骤(2)中所述发酵培养的条件为：在18～35℃、90～250rpm振荡条件下，培养6～18天。进一步优选地，所述碳源包括可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、马铃薯粉、大米粉、玉米粉、半乳糖、甘露糖中的至少一种。更优选为果糖。进一步优选地，所述氮源包括牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、酵母粉、酵母浸出液、酵母膏、豆饼粉、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、玉米干粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3中的至少一种。更优选为酵母粉。进一步优选地，所述无机盐包括MgSO4、KI、CaCl2、CaCO3、KH2PO4、NaH2PO4中的至少一种。进一步优选地，所述微量元素包括H3BO3、ZnSO4、MnSO4、Na2MoO4、CoCl2、CuSO4、FeSO4中的至少一种。进一步优选地，所述生长因子包括肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸中的至少一种。更优选为肌醇。进一步地，步骤(2)中所述生物合成EGT的前体物质包括蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、酪氨酸(Tyr)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Hcy)中的至少一种。进一步优选地，步骤(2)中所述发酵培养基组成为：1～10％(w/v)果糖、0.1～2％(w/v)的酵母粉、0.001～0.05％(w/v)MgSO4、0.01～0.05％(w/v)KH2PO4、0.0001～0.001％(w/v)MnSO4，0.001～0.005％(w/v)的肌醇。进一步地，步骤(3)中所述乙醇溶液是指浓度为70％的乙醇溶液，所述菌丝发酵液与乙醇溶液的体积比为1:9。进一步地，步骤(3)中所述超声浸提的时间为30min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过对发酵培养基中的碳源、氮源、生长因子、无机盐等成分进行优化，显著提高了发酵液中EGT的产量，在优化条件下，发酵液中的EGT的产量达到500mg/L以上，最高可达600mg/L。(2)本专利技术通过乙醇超声提取法，可快速简便有效的提取菌丝体中的EGT，可有效的减少一些发酵副产物对后续EGT检测的干扰。附图说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)将暗褐网柄牛肝菌固体菌种接种至母种培养基中培养获取母种菌液；/n(2)将获得的母种菌液接种至发酵培养基中，同时添加生物合成EGT的前体物质进行发酵培养，得到菌丝发酵液；/n(3)将步骤(2)所得菌丝发酵液采用乙醇溶液超声浸提，过滤得到含有EGT的提取液。/n

【技术特征摘要】
1.一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将暗褐网柄牛肝菌固体菌种接种至母种培养基中培养获取母种菌液；
(2)将获得的母种菌液接种至发酵培养基中，同时添加生物合成EGT的前体物质进行发酵培养，得到菌丝发酵液；
(3)将步骤(2)所得菌丝发酵液采用乙醇溶液超声浸提，过滤得到含有EGT的提取液。


2.根据权利要求1所述的一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法，其特征在于：步骤(1)中所述母种培养基包括以下组分：0.5～8％果糖、0.5～2％玉米干粉、0.5～2％酵母粉、0.02～0.2％KH2PO4、0.01～0.1％MgSO4、0.01～0.1％CaCl2，pH4.0～6.0；所述母种培养基中培养条件为：在18～35℃、90～250rpm振荡条件下，培养6～11天。


3.根据权利要求1或2所述的一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法，其特征在于：步骤(2)中所述发酵培养基包括以下组分：1～10％碳源、0.1～5％氮源、0.01～2％无机盐、0.0001～0.5％微量元素、0.001～0.01％生长因子、pH4.0～6.0；所述发酵培养的条件为：在18～35℃、90～250rpm振荡条件下，培养6～18天。


4.根据权利要求3所述的一种暗褐网柄牛肝菌液体发酵制备麦角硫因的方法，其特征在于：所述碳源包括可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、马铃薯粉、大米粉、玉米粉、半乳糖、甘露糖中的至少一种；所述氮源包括牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、酵母粉、酵母浸出液、酵母膏、豆饼粉、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、玉米干粉、尿素、(NH4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建，焦春伟，谢意珍，吴清平，陈家明，
申请(专利权)人：广东粤微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44