利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法技术

本申请涉及一种利用生物多酶偶联法制备L‑草铵膦的方法，其包括：a)在(R)‑转氨酶和氨基受体的存在下，使D,L‑草铵膦发生转氨反应得到2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸和氨基受体的加氨基产物；b)在(S)‑转氨酶和氨基供体的存在下，使步骤a)中得到的2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸发生转氨反应得到L‑草铵膦和氨基供体的脱氨基产物。本申请的方法能够实现高浓度D,L‑草铵膦的高效拆分来制备L‑草铵膦。

【技术实现步骤摘要】
利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法
本申请涉及生物
，特别是涉及一种利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法。
技术介绍
草铵膦(又名双丙氨膦、草丁膦，商品名包括保试达、百速顿等，英文名为phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)是德国赫斯特公司(现属于拜耳公司)在20世纪80年代开发的一种具有低毒、高效、非选择性触杀型有机磷除草剂。草铵膦作用机制是，草铵膦作用植株后，可以抑制谷氨酰胺合成酶，从而中断植物体内谷氨酸的可逆反应，造成代谢紊乱，堆积过量的氨，使植物中毒，同时导致植物无法合成叶绿素，叶绿体解体，植物的光合作用就会受到抑制，导致植物死亡。草铵膦主要用于果园、马铃薯田、非耕地等防治一年生和多年生的禾本科及双子叶杂草，如马唐、狗尾草、野小麦；多年生的禾本科杂草和莎草，如羊茅、鸭芽等。草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦，但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。现有制备手性纯L-草铵膦的方法主要两种：化学法和生物法。其中化学法包括化学拆分法和化学合成法。化学拆分法是通过手性拆分试剂拆分外化学法合成的消旋D,L-草铵膦或其衍生物，从而制得光学纯的L-草铵膦。Hoechst公司于1998年报道了利用奎宁作为拆分剂拆分草铵膦消旋体，实现了D-和L-草铵膦的分离(美国专利US5767309)。然而该工艺存在需要使用手性拆分试剂、D-草铵膦需要消旋再利用，需要多次拆分等缺点，难以规模工业化生产。化学合成法以天然手性氨基酸或者不对称法合成L-草铵膦。例如Hoechst公司报道了利用L-谷氨酸或L-天冬氨酸为手性源合成L-草铵膦(HoffmannMG,ZeissHJ.AnovelandconvenientroutetoL-homoserinelactonesandL-phosphinothricinfromL-asparticacid[J].TetrahedronLetters,1992,33(19):2669-2672.和欧洲专利EP0530506)。但是该过程氨基保护与脱保护过程复杂，步骤较多，多见于实验室研究中。L-草铵膦工业化是明治制果采用不对称催化加氢法率先实现的(国际专利WO2006104120)。但该路线所使用的催化剂价格昂贵，反应路线较长，工业化成本较高。相比之下，生物催化法具有反应条件温和、立体选择性高、收率高等优点，是工业化制备L-草铵膦的重要趋势。生物催化法制备L-草铵膦的方法目前大多是2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经氨化反应，不对称合成L-草铵膦。其中CN1349561A描述了将天冬氨酸作为氨基供体，利用筛选的天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)通过转氨作用将PPO合成L-草铵膦。该工艺使用与PPO大约等摩尔量的氨基供体，生成的草酰乙酸在水中水解成丙酮酸，经酶促反应去除，不存在可逆反应。然而此工艺效率较低，底物PPO转化率仅有52％，反应条件苛刻(80℃)。专利CN105603015B描述了一种以L-丙氨酸为氨基供体的氨基转移酶生产L-草铵膦的方法。该工艺能够将100mM的PPO完全转化成L-草铵膦，但是为了抑制逆反应，丙氨酸投量过高，反应结束仍有300mM的L-丙氨酸存在体系中，为后续分离纯化造成困难，同时反应温度高达50℃，能耗较高，不利于生产。另外还有的方法在氨基酸脱氢酶的介导下，以无机氨为供体，将PPO还原胺化制备L-精草铵膦，例如CN106978453A，反应过程采用无机氨，转化率能够达到99％以上，然而该工艺需要额外添加辅酶再生系统，提高了分离纯化的难度。上述工艺都以PPO为原料，但PPO的成本很高，从而导致这些工艺生产L-草铵膦的成本很高，难以实现工业化。因此，国际专利WO2017151573A1描述了一种以D，L-草铵膦为原料生产L-精草铵膦的方法，该工艺采用D-氨基酸氧化酶氧化D-草铵膦获得PPO，再由转氨酶经转氨反应将PPO转化为L-草铵膦。尽管该工艺实现了草铵膦消旋体的动态动力学拆分，但是该工艺存在明显缺陷：一是底物投量难以提升(仅有300mMD,L-草铵膦)；二是转氨酶介导的PPO到L-草铵膦的反应，由于受到可逆反应影响，仅能实现90％的转化率；三是由于胺供体是L-谷氨酸，反应后仍有大量剩余，产物分离纯化困难。因此迫切需要开发一种能够高效实现动态拆分高浓度D,L-草铵膦来制备L-草铵膦的方法。
技术实现思路
本申请提供了一种利用生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，其以D,L-草铵膦为原料，经多酶催化体系获得L-草铵膦。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低，易于工业化。在一些实施方式中，本申请提供了一种制备L-草铵膦的方法，其包括：a)在(R)-转氨酶和氨基受体的存在下，使D,L-草铵膦发生转氨反应得到2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸和氨基受体的加氨基产物；b)在(S)-转氨酶和氨基供体的存在下，使步骤a)中得到的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸发生转氨反应得到L-草铵膦和氨基供体的脱氨基产物。在步骤a)中，以外消旋D,L-草铵膦为底物，在微量氨基受体例如丙酮酸(反应后无需分离)存在的条件下，(R)-转氨酶将D-草铵膦的氨基转移到氨基受体上，脱氨生成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)，而L-草铵膦不参与反应而完全保留。转氨酶(AmineTransaminase,ATA,EC2.6.1.X)属于转移酶类，是催化1个氨基供体(氨基酸或简单的胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸的一类酶，其催化的反应是可逆的。根据氨基被转移到不同位置的氨基受体上，转氨酶又可以被分为α-转氨酶和ω-转氨酶(EC2.6.1.1)。ω-转氨酶反应过程可分为两步，第一步反应是在ω-转氨酶的作用下将氨基供体上的氨基转移到PLP的羰基上，从而形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和与氨基供体对应的酮；第二步反应同样在ω-转氨酶的作用下将PMP上的氨基转移到氨基受体上，PMP又转变为PLP实现循环。转氨酶的立体选择性可在包含手性中心的底物外消旋混合物的外消旋拆分中测定。ω-转氨酶根据立体选择性可分为“(R)-转氨酶”((R)-aminetransaminase)和(S)-转氨酶((S)-aminetransaminase)。根据本申请，(R)-转氨酶可以是在存在酮底物(例如丙酮酸)的情况下，优先从外消旋D,L-草铵膦中诱导D-草铵膦的转氨反应的酶。(R)-转氨酶可以为本领域已知的任何具有(R)-转氨酶活性的酶。在一些实施方式中，所述(R)-转氨酶为选自以下中的任一种：APH1(例如NCBI序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备L-草铵膦的方法，其包括：/na)在(R)-转氨酶和氨基受体的存在下，使D,L-草铵膦发生转氨反应得到2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸和氨基受体的加氨基产物；/nb)在(S)-转氨酶和氨基供体的存在下，使步骤a)中得到的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸发生转氨反应得到L-草铵膦和氨基供体的脱氨基产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备L-草铵膦的方法，其包括：
a)在(R)-转氨酶和氨基受体的存在下，使D,L-草铵膦发生转氨反应得到2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸和氨基受体的加氨基产物；
b)在(S)-转氨酶和氨基供体的存在下，使步骤a)中得到的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸发生转氨反应得到L-草铵膦和氨基供体的脱氨基产物。


2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)中另外存在能够使所述氨基受体的加氨基产物转化为所述氨基受体的催化酶。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中另外存在能够除去所述氨基供体的脱氨基产物的催化酶。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤a)之后和步骤b)之前还包加热步骤，所述加热步骤使步骤a)的反应混合物中的酶灭活。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在同一反应器中进行。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述氨基受体为丙酮酸，所述氨基受体的加氨基产物为D-丙氨酸。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述氨基供体为L-丙氨酸，所述氨基供体的脱氨基产物为丙酮酸。


8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中在步骤a)中能够使所述氨基受体的加氨基产物转化为所述氨基受体的所述催化酶为D-氨基酸氧化酶。


9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中在步骤b)中能够除去所述氨基供体的脱氨基产物的所述催化酶为丙酮酸脱酸酶。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的反应中另外存在过氧化氢酶。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述(R)-转氨酶、(S)-转氨酶、能够使所述氨基受体的加氨基产物转化为所述氨基受体的催化酶、能够除去所述氨基供体的脱氨基产物的催化酶和所述过氧化氢酶的形式各自独立地选自：部分纯化的酶；无细胞提取物或粗细胞提取物；液体、粉末或固定形式；含有酶的可透化处理的细胞、完整细胞或完整发酵液、冻干细胞或其任何组合。


12.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤a)包括：
a)在共表达(R)-转氨酶和能够使所述氨基受体的加氨基产物转化为所述氨基受...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东芝，王华磊，吴承骏，刘清海，罗中华，张长雷，
申请(专利权)人：永农生物科学有限公司，华东理工大学，宁夏永农生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33