手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物的制备方法技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体为一种手性顺式‑

【技术实现步骤摘要】
手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物的制备方法
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物的制备方法。
技术介绍
手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物是一种广泛存在于药物分子如甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素、屈西多巴、依利格鲁司他，以及活性天然产物结构中的基本骨架，其结构式如(I)所示，式中R1为氢、甲砜基、硝基、甲硫基、卤族元素、醚基、三氟甲基、C1-C6烷基或环烷基；R2为叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、苄基、乙酰基、对甲氧苯基、三苯甲基衍生物保护基；R3为C1-C8烷基或环烷基、单取代或多取代芳基。目前关于通过动态还原动力学拆分合成化合物(I)及其结构类似物的化学方法有很多报道，但这些化学方法普遍存在一些不足之处，例如常需要使用过渡金属钌或铑，严重污染环境(Org.Lett.2017,19,4339-4342；Org.ProcessRes.Dev.2019,23,1204-1212)，限制了其在工业生产上的应用。另外，生物催化动态还原动力学拆分方法由于其高立体选择性以及环境友好被大家所关注，但很少被用于合成化合物(I)及其结构类似物。在早期研究中，默克公司报道了如反应式B所示通过羰基还原酶CDX-018催化还原化合物(III)，选择性地生成得到顺式的化合物(IV)，ee值大于99％，dr值大于99:1，收率为92％(Org.Lett.2013,15,1342-1345)；最近，张福利和陈少欣团队合作报道通过羰基还原酶KRED-02催化的动态还原动力学拆分制备手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物(中国专利技术专利申请201710533399.3；Eur.J.Org.Chem.2018,5044-5053)，包括用于合成氟苯尼考的关键中间体(V)，反应的收率高、立体选择性选择性优异。尽管有这两个报道，通过羰基还原酶催化的动态还原动力学拆分来制备手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物依然很急需，特别是适用于工业生产的方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种底物普适性广、高底物浓度、高效、高立体选择性、高收率的手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物的制备方法。所述手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物，其结构式为(I)所示：式中，R1为氢、甲砜基、硝基、卤族元素、醚基、三氟甲基；R2为叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、苄基、对甲氧苯基、三苯甲基衍生物保护基；R3为C1-C8烷基、单取代或多取代芳基。所述手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物的制备方法，采用来源于苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)的羰基还原酶催化不对称还原β-芳基-β-氧代-α-氨基丙酸酯类化合物(II)生成化合物(I)，具体步骤为：(1)制备含羰基还原酶基因的第一工程菌和含葡萄糖脱氢酶基因的第二工程菌；(2)分别制备两种工程菌的静息细胞悬浊液；(3)分别制备含羰基还原酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液；(4)将上述两种细胞上清液混合，然后再与化合物(II)、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，制得化合物(I)；其反应式，如下：其中，所述氢供体为葡萄糖，所述辅因子为NADP+/NADPH；所述羰基还原酶(简称KRED-Bt)的对应氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术步骤(1)中,所述工程菌含有表达载体pET-28a-KRED-Bt，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术步骤(2)中,所述制备两种工程菌的静息细胞悬浊液，具体步骤为：将第一工程菌或第二工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.8-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液。进一步地，所述诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.05mM-0.8mM；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为15-25℃，培养时间为8-24h。进一步地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为30-300mM。本专利技术步骤(3)中,所述制备两种细胞上清液的方法，具体步骤为：对所述第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液进行超声破碎，离心，获得所述第一细胞上清液或所述第二细胞上清液。本专利技术步骤(4)中,所述两种细胞上清液的混合液中，所述第一细胞上清液和所述第二细胞上清液的体积比为20:1-1:2。更优选两者体积比为10:1-8:1。本专利技术步骤(4)的不对称氧化还原反应中，所述化合物(II)的浓度为1.0-300g/L，所述第一静息细胞悬浊液的细胞浓度为0.1g湿重/L-25g湿重/L，所述第二静息细胞悬浊液的细胞浓度为0.1g湿重/L-25g湿重/L，所述氢供体的浓度为5-750g/L，所述辅因子的浓度为0-0.5mM。在整个不对称还原反应过程中，一方面羰基还原酶KRED-Bt催化还原化合物(II)动态还原动力学拆分生成立体异构纯的化合物(I)；另一方面，葡萄糖脱氢酶(GDH)将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯，同时消耗了氧化型辅酶因子NADP+，再生了还原型辅酶因子NADPH，还原型辅酶因子NADPH将提供氢给底物,自身又被氧化成氧化型辅酶因子NADP+,形成了一个辅酶因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。不对称还原反应中，反应的温度为20-40℃，反应缓冲液pH为6.0-9.0。更优选，反应温度为20-25℃，反应缓冲液pH为6.5-7.5。缓冲浓度为100-250mM。不对称还原反应中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液与助溶剂的混合溶剂。其中，助溶剂选自高介电常数溶剂：二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺，芳香族溶剂：苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯，非极性溶剂：正己烷、环己烷，以及极性溶剂：乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种。优选的溶剂为二甲基亚砜、磷酸缓冲液的混合溶剂，体积比为10:90。在整个反应过程中，待反应至GC检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3～4次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠洗涤2次，水洗1次，饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标产物。与现有专利技术技术相比，本专利技术具有以下效果：本专利技术构建含羰基还原酶KRED-Bt和含葡萄糖脱氢酶GDH的工程菌应用于催化还原化合物(II)，为化合物(I)的生产提供了一种新的生物制备途径。相对于其它制备方法，使用本专利技术方法制备所得的含羰基还原酶KRED-Bt和含葡萄糖脱氢酶GDH的工程菌具有对环境友好、操作简便、易于工业放大等优势，且能以底物普适性广、高底物浓度、高效、高立体选择性、高收率得到化合物(I)，具有很好的工业应用前景。附图说明图1为基因工程菌诱导表达的KRED-Bt细胞上清液蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种手性顺式-

【技术特征摘要】
1.一种手性顺式-β-芳基-β-羟基-α-氨基酯类化合物的制备方法，采用羰基还原酶催化不对称还原β-芳基-β-氧代-α-氨基丙酸酯类化合物（II）生成化合物（I），具体步骤为：
（1）制备含羰基还原酶基因的第一工程菌和含葡萄糖脱氢酶基因的第二工程菌；
（2）分别制备两种工程菌的静息细胞悬浊液；
（3）分别制备含羰基还原酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液；
（4）将上述两种细胞上清液混合，然后再与化合物（II）、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，制得化合物（I）；其反应式，如下：

；
其中，所述氢供体为葡萄糖，所述辅因子为NADP+/NADPH；所述羰基还原酶的对应氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌含有表达载体pET-28a-KRED-Bt，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述制备两种工程菌的静息细胞悬浊液，具体步骤为：将第一工程菌或第二工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.8-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.05mM-0.8mM；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为15-25℃，培养时间为8-24h；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为30-300mM。


5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述制备两种细胞上清液，具体步骤为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芬儿，黄则度，张青春，胡辰，孟歌，程荡，姜梅芬，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31