用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其方法和应用技术

本发明专利技术涉及疾病治疗领域，具体而言，本发明专利技术涉及抑制新型冠状病毒感染的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，编码多肽的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。本发明专利技术进一步涉及所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体在预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病中的用途，以及在制备预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】
用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其方法和应用
本专利技术涉及疾病治疗领域，具体而言，本专利技术涉及用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，编码多肽的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物(例如药物制剂)。本专利技术进一步涉及所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体在预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病中的用途，以及在制备预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的用途。
技术介绍
新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。根据中国卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第五版)》，本次新型冠状病毒导致感染的临床表现包括：潜伏期1-14天，一般为3-7天，以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状；轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现；重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。根据报道，新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19病死率约3.06％，基本传染数Ro达到3.77(YangYang等，BioRxiv，2020.2.11)。此次疾病爆发对人类的生存与健康带来了严重的威胁，也给社会经济的发展带来了严重的影响。截至目前，尚没有针对新型冠状病毒SARS-CoV-2感染疾病的特效药物，临床主要通过对症支持治疗为主。亟待开发相应预防及治疗药物，控制疾病进一步扩散，挽救危重病人生命。冠状病毒为单链RNA的包膜病毒，将其分为α、β、γ和δ四个类别，β类别可分为A-D四个亚组。目前为止，已发现6种病毒分子(除SARS-CoV-2)，分别可导致不同的疾病类型，主要临床表现在上呼吸道和胃肠道感染。SARS和MERS病毒感染会导致患者肺炎、肾衰等严重器官损伤而发生死亡。据统计，SARS和MERS导致的患者死亡率分别为9％，36％。冠状病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有3种糖蛋白：刺突糖蛋白(S蛋白，Spikeprotein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)、小包膜糖蛋白(E蛋白，Envelopeprotein，较小，与包膜结合的蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白，Membraneproten，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出牙释放与病毒外包膜的形成)。其中β属A群冠状病毒的包膜上还具有一个较短的刺突蛋白，即凝血素糖蛋白(HE蛋白，Heamaglutininesterase)。在病毒内部，为病毒的核衣壳蛋白(N蛋白，nulceocapsidphosphorprotein)，其上附着有病毒的基因组单正链RNA。冠状病毒的感染步骤，包括吸附入侵、基因合成、成熟病毒的包装和释放这4个过程，其中病毒吸附入侵的关键步骤是病毒受体的特异性。在冠状病毒感染宿主细胞的过程中，S蛋白特异性识别细胞表面受体并形成复合物，是决定病毒入侵的关键性因素。S蛋白可被宿主细胞酶切割为S1和S2亚单位，其中S1负责受体的识别，而S2启动病毒与宿主的膜融合。S1亚基上具有宿主受体结合区(RBD)，相关受体包括CD13(APN)、唾液酸(SA)、ACE2、CD26(DPP4)等；S2亚基上具有HR1(heptadrepeat1)和HR2区，HR1通过形成同源三聚体暴露3个高度疏水的凹槽结构，该结构能与HR2结合，进而形成六螺旋束的核心结构，协助病毒与细胞膜的融合，从而使病毒进入靶细胞。初步研究发现SARS-CoV-2与SARS病毒一样，均是通过S蛋白结合人体细胞表面的ACE2蛋白进入细胞(TianleiYing,bioRxiv,2020；VincentMunster，bioRxiv,2020)。McLellan等人发现(DanielWrapp等，BioRxiv，2020.2.15)，SARS-CoV-2与人ACE2的亲和力是SARS病毒的10-20倍，进一步解释了SARS-CoV-2较SARS病毒具有更强的传染能力的原因。因此，针对SARS-CoV-2等冠状病毒感染人体细胞的路径研发特异性预防或治疗药物也是目前药物研发的重要方向。
技术实现思路
在本专利技术中，专利技术人开发了能够用于抗冠状病毒(如SARS-CoV-2)感染动物细胞(尤其是阻断冠状病毒感染)的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。该多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体通过竞争性阻断SARS-CoV-2等冠状病毒融合进入细胞的过程，以降低或阻止病毒感染风险，减少发病率，防止病毒进一步传播。SARS-CoV-2病毒融合进入细胞的过程包括病毒表面S蛋白的S1亚基与人体特异性受体ACE2结合，再通过S2亚基启动病毒与宿主细胞膜的融合。在冠状病毒融合过程中，S蛋白的S2区域的中有两个关键区域HR1和HR2，HR1会先形成三聚体，然后结合三个HR2形成稳定复合物，为病毒融合进入细胞的必须结构。本专利技术针对该融合过程中的不同靶点设计特异性结合分子，阻断病毒与人体细胞的融合过程。本专利技术一个方面提供一类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体以SARS-CoV-2病毒的S2亚基中HR1区域作为靶标。该类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体能够阻断病毒S2亚基中的HR1与HR2结合形成六聚体，进而阻断病毒与人体细胞融合，抑制病毒感染人体。在某些实施方案中，该类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，包含：(1)如SEQIDNO:1、3或4任一氨基酸序列所示的多肽；(2)与(1)所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的多肽；或者(3)与(1)所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，本专利技术的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，具有如下的氨基酸序列：(1)如SEQIDNO:1、3或4任一所示的氨基酸序列；(2)与(1)所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者(3)与(1)所示序列具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.能够抑制冠状病毒感染的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，包含：/n(1)如SEQ ID NO:1，3-6任一氨基酸序列所示的多肽；/n(2)与(1)所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的多肽；或者/n(3)与(1)所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.能够抑制冠状病毒感染的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，包含：
(1)如SEQIDNO:1，3-6任一氨基酸序列所示的多肽；
(2)与(1)所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的多肽；或者
(3)与(1)所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。


2.根据权利要求1所述的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，所述多肽具有如下的氨基酸序列：
(1)如SEQIDNO:1，3-6任一所示的氨基酸序列；
(2)与(1)所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者
(3)与(1)所示序列具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。


3.根据权利要求1或2所述的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，其包含如SEQIDNO:1，3-6任一氨基酸序列所示的多肽。


4.根据权利要求1-3任一所述的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，其多肽具有如SEQIDNO:1，3-6任一所示的氨基酸序列；
优选的，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1，3-6任一所示。
优选的，所述多肽的氨基酸序列以SEQIDNo：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有一个，两个，三个，四个，五个，六个或七个突变，所述突变后的氨基酸选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。


5.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项所述的任一多肽；
可选的，所述分离的核酸分子包含与异源启动子可操作性连接的编码权利要求1-4任一项所述的任一多肽的核苷酸序列。


6.载体，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子；
优选的，所述载体为克隆载体或表达载体；更有选的，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体。


7.宿主细胞，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子或权利要求6所述的载体；
优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；更有选的，所述原核细胞是大肠杆菌细胞，所述真核细胞是酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞、小鼠细胞、人细胞等)。


8.制备权利要求1-4任一所述多肽的方法，所述方法包括基因工程表达的方式或化学合成的方式制备。


9.根据权利要求8所述的方法，所述基因工程表达的方式包括将编码多肽的的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在允许所述多肽表达的条件下，培养宿主细胞，从培养的宿主细胞培养物中回收所述多肽；
优选的，所述回收还可以包括通过免疫亲和纯化等方式来纯化多肽的步骤。


10.根据权利要求8所述的方法，所述化学合成的方式包括固相方法合成多肽，溶液中合成多肽或酶促合成多肽，或其任意组合。


11.根据权利要求8所述的方法，所述化学合成的方式包括如下步骤：
(1)将树脂固相载体和Fmoc保护的碳端第一个氨基酸(如Fmoc-AA-OH)偶联，得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基，得到H-AA-树脂；
(2)通过固相合成法，在偶联剂系统的存在下，按多肽氨基酸序列由碳端向氮端依次将保护氨基酸偶联到H-AA-树脂上，制备得到线性多肽的肽树脂；
(3)线性多肽的肽树脂经裂解，制得多肽；
优选的，步骤(1)中所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；更优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成；
优选的，步骤(1)固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；更优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～1.0mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.4-1.1mmol/g；
优选的，步骤(2)中所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；更优选地，所述缩合剂为HOBt/DIC，反应溶剂为DMF；
优选的，步骤(3)所述的裂解采用的裂解试剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；更优选地，所述的裂解试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7：1～5的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H2O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H2O和苯甲硫醚组成的混合溶液；更优选地，所述的裂解试剂由体积比为92:4:2:2的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88:2:5:5或90:2:5:3的TFA、TIS、H2O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88:2:5:5的TFA、TIS、H2O和苯甲硫醚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为95:5的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶翼，薛彤彤，赵栋，肖亮，戚建英，喻海旻，龙虎，刘登念，沈利，赵忠琼，林丽洋，刘晨，
申请(专利权)人：四川科伦博泰生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51