尿液稳定化制造技术

本公开提供了一种用于稳定尿液样品的方法，所述方法包括将用于稳定化的尿液样品与EDTA、至少一种聚(氧乙烯)聚合物和用于抑制细菌生长的防腐剂接触。本公开还提供了用于处理稳定化尿液样品的稳定化组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】尿液稳定化
本专利技术提供了用于稳定尿液样品的方法、组合物和收集容器。本专利技术的技术允许同时稳定无细胞和基因组DNA以及稳定尿液中的细胞。
技术介绍
体内大部分DNA位于细胞内，但也可以发现少量核酸在人类体液如血液和尿液中自由循环(通常称为细胞外DNA、无细胞DNA或也称为循环DNA)。在许多医学病状、恶性肿瘤和感染过程中，细胞外DNA和其他细胞外核酸水平升高的存在对于筛查、诊断、预后、疾病进展监视、识别潜在治疗靶点和监测治疗反应是尤其受关注的。体液样品中细胞外DNA的降解是一个问题，并且根据样品类型，样品收集后受损或腐烂的细胞的遗传物质可能会稀释细胞外DNA。为了避免或减少上述问题，例如建议在抽取血液后基本上立即从全血中获得血浆和/或稳定血液样品直到可以获得血浆。同时，从血液样品中稳定和分离细胞外DNA已得到充分确立。对于血液样品的稳定化，市售有几种专用的采血管(Streck、Roche、PreAnalytiX、Biomatrica、Norgene等)。稳定化方法例如描述于WO2013/045457、WO2013/045458、WO2014/146780、WO2014/146782、WO2014/146781、WO2014/049022和WO2017/085321。尽管与进行活检相比，抽血的侵入性要小得多，但仍然是侵入性的，并且尤其是在接受治疗的老年人、婴儿或癌症患者的情况下可能很困难或不可能。作为治疗监测、耐药性失败测试甚至诊断的替代来源的真正无创样品将是对当前液体活检技术的宝贵补充。从尿液中纯化无细胞DNA在此提供了一种方便且完全非侵入性的替代方法。许多同行评议的文章表明，尿液可以用作液体活检。除了对尿路上皮癌的常规细胞组织学分析外，尿液中癌细胞或恶性细胞的gDNA和无细胞DNA与癌症特异性序列、表观遗传和结构变化相关。已经公开，来自以下癌症患者的尿液含有肿瘤源性的无细胞DNA：膀胱癌(K等人,膀胱癌患者液体活检的基因组改变(GenomicAlterationsinLiquidBiopsiesfromPatientswithBladderCancer).EurUrol.2016年7月；70(1):75-82)、前列腺癌(SalviS等人,用于前列腺癌患者早期检测的尿液无细胞DNA完整性分析(UrineCell-FreeDNAIntegrityAnalysisforEarlyDetectionofProstateCancerPatients).DisMarkers.2015；2015:574120)、肺癌(ChenS,ZhaoJ,CuiL,LiuY.用于动态追踪使用EGFR-TKI治疗的NSCLC患者的EGFR突变的尿循环DNA检测(UrinarycirculatingDNAdetectionfordynamictrackingofEGFRmutationsforNSCLCpatientstreatedwithEGFR-TKIs).ClinTranslOncol.2017年3月；19(3):332-340)和其他实体瘤癌症类型(FujiiT等人,用于定量检测晚期癌症患者尿液无细胞DNA中KRAS突变的突变富集下一代测序(Mutation-EnrichmentNext-GenerationSequencingforQuantitativeDetectionofKRASMutationsinUrineCell-FreeDNAfromPatientswithAdvancedCancers).ClinCancerRes.2017年7月15日；23(14):3657-3666)。此外，还描述了从尿液样品中分离胎儿DNA。因此，除了血液之外，尿液也是一种重要的液体活检样品。然而，尿液中的有核细胞和无细胞DNA都不稳定，并且在尿液样品收集后迅速溶解或降解。此外，尿液中脱落的有核细胞(例如正常上皮细胞或癌症源性细胞)会释放基因组DNA，其导致无细胞DNA的稀释。尿液中的DNA降解特别迅速，并且基本上在样品收集后立即发生。因此，需要有效的稳定化方法以通过减少储存期间尿液样品中包含的无细胞DNA的降解来保存尿液样品中的无细胞DNA。在这方面，应注意，基于储存后尿液样品中包含的无细胞DNA的总量，难以确定最初尿液样品中包含的无细胞DNA的有效保存。这是因为在储存期间降解的最初存在的无细胞DNA可以被包含在尿液样品中的细胞释放的DNA补充。因此，即使在尿液样品收集时和储存后无细胞尿液级分中DNA的总量相同，但最初存在的无细胞DNA仍可能被降解而储存后无细胞尿液级分中包含的DNA可能基本上对应于储存期间从细胞中释放的DNA。然而，具有特定分析价值的是最初存在于无细胞尿液级分中的无细胞DNA，而不是在储存期间从细胞释放到无细胞尿液级分中的DNA。如果最初存在的无细胞DNA在储存期间降解，则其无法用于后续分析。因此，尿液稳定化的一个重要目的是将样品收集时尿液中包含的无细胞DNA稳定化。此外，希望尿液稳定化技术实现所含细胞的稳定化，从而可以从稳定化的尿液样品中回收细胞以供进一步使用，例如细胞组织学测试方法和/或从细胞中分离基因组DNA。已知的尿液稳定化方法并没有充分解决这些目标。一种已知的尿液稳定化方法(Streck–无细胞DNA尿液保存)是基于使用甲醛释放剂。无细胞DNA尿液防腐剂以5ml小瓶提供。一个小瓶中的试剂必须与25至100ml尿液混合。这种方法有几个缺点。它要求将未稳定化的尿液带到实验室或医生办公室。从而延迟了尿液被稳定化的时间点。此外，为了稳定化，必须打开初级收集杯并且必须从小瓶中加入稳定化试剂并与尿液混合。这些手动交互不方便且容易出错。此外，含有甲醛的试剂具有有毒和化学修饰生物分子如蛋白质和核酸的缺点。这会减少可回收并因此可分析的无细胞DNA的量。由于尿液样品中所关注的无细胞DNA的数目可能有限，这是一个巨大的缺点。Trovagene有一种试剂(NextCollect)，根据制造商，它可以稳定尿液中的无细胞DNA。这种试剂被整合到尿液收集容器的杯子中。Zymo和Norgen提供了可以保存尿液以用于后续的总DNA应用的试剂。然而，对基因组和无细胞DNA进行单独分析是不可能的。此外，本领域已知若干其他尿液收集装置。例如BectonDickenson(BD)提供了用于将尿液转移到真空容器的产品线。BD尿液收集杯是一种收集容器，具有一个带针头的杯子，用于将尿液转移到真空容器中，而无需打开杯子。BD尿液收集吸管是一种将尿液从任何容器转移到真空容器的装置。将所述装置的一端放入尿液中，另一端包括一根可以连接到真空容器的针头。BD尿液分析保存管是具有喷雾干燥的细菌防腐剂的真空容器，抽取体积为8ml，或不含添加剂且抽取体积为8至10ml的管，旨在用于尿液。这些真空容器都不能保存DNA。因此需要改进的方法以允许将尿液样品有效地稳定化为液体活检样品。稳定化应该允许随后分离在尿液样品中包含的无细胞DNA以及细胞。因此，本专利技术的一个目的是提供用于稳定尿液样品的手段。特别地，一个目的是克服现有技术尿液稳定化方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于稳定尿液样品的方法，所述方法包括将用于稳定化的所述尿液样品与螯合剂和至少一种聚(氧乙烯)聚合物接触，其中在稳定化尿液样品中细菌生长得以抑制。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190104 EP 19150438.01.一种用于稳定尿液样品的方法，所述方法包括将用于稳定化的所述尿液样品与螯合剂和至少一种聚(氧乙烯)聚合物接触，其中在稳定化尿液样品中细菌生长得以抑制。


2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述尿液样品与用于抑制细菌生长的防腐剂接触。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA。


4.根据权利要求1至3中的一项或多项所述的方法，所述方法包括将所述尿液样品与稳定化组合物接触，所述稳定化组合物包含螯合剂，优选EDTA，和所述聚(氧乙烯)聚合物，优选聚乙二醇，以及任选的用于抑制细菌生长的防腐剂。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述稳定化组合物包含缓冲剂并且具有在>7至9.5，例如7.2至9.5、7.3至9.5、7.4至9.5或7.5至9.5的范围内的pH。


6.根据权利要求5所述的方法，其中将所述稳定化组合物与所述尿液样品以选自1:3至1:10、优选1:5至1:8的体积比接触。


7.根据权利要求1至6中的一项或多项所述的方法，其中所述稳定化尿液样品的pH在6至9.5，例如6.3至9.5、6.5至9.5、6.7至9、7至9或7.2至9的范围内。


8.根据权利要求3至6中的一项或多项所述的方法，所述方法具有以下特性中的一项或多项：
(i)其中在所述稳定化尿液样品中，EDTA的最终浓度在2mg/ml至40mg/ml，优选10mg/ml至30mg/ml的范围内；
(ii)所述方法包括将所述尿液样品与稳定化组合物接触，所述稳定化组合物包含最终浓度在100mM直至溶解度极限，优选150mM至500mM的范围内的EDTA。


9.根据权利要求1至8中的一项或多项所述的方法，其中所述至少一种聚(氧乙烯)聚合物是聚乙二醇。


10.根据权利要求1至9中的一项或多项所述的方法，其中将所述尿液样品与具有至少1500的分子量的高分子量聚(氧乙烯)聚合物和具有1000或更低的分子量的低分子量聚(氧乙烯)接触，并且其中优选地这些聚合物被包含在根据权利要求4的所述稳定化组合物中。


11.根据权利要求2至10中的一项或多项所述的方法，其中所述用于抑制细菌生长的防腐剂是具有以下特性中的一项或多项的防腐剂：
(a)它是抗微生物剂并且优选具有抗细菌和抗真菌作用，
(b)所述防腐剂包含一种化学化合物或两种或更多种化学化合物或者由一种化学化合物或两种或更多种化学化合物组成，
(c)所述防腐剂包含叠氮化钠或由叠氮化钠组成，
(d)所述防腐剂包含至少一种异噻唑啉酮化合物，优选甲基氯异噻唑啉酮和/或甲基异噻唑啉酮；
(e)所述防腐剂包含氯己定；
(f)所述防腐剂包含硼酸钠。


12.根据权利要求1至11中的一项或多项所述的方法，其中将所述尿液样品另外与至少一种半胱天冬酶抑制剂接触，并且其中优选地，所述半胱天冬酶抑制剂被包含在根据权利要求4的所述稳定化组合物中。


13.根据权利要求4至12中的一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物包含：
-EDTA，
-至少一种聚乙二醇，优选至少一种具有至少3000的分子量的高分子量聚乙二醇和任选的至少一种具有1000或更低的分子量的低分子量聚乙二醇，
-用于抑制细菌生长的防腐剂，
-缓冲剂，
-至少一种半胱天冬酶抑制剂，和
-任选的至少一种伯酰胺、仲酰胺或叔酰胺。


14.根据权利要求13所述的方法，其中所述稳定化组合物是液体组合物，所述组合物包含
-浓度为100mM直至溶解度极限，优选150mM至500mM的EDTA，
-至少一种聚乙二醇，优选至少一种具有至少6000的分子量的高分子量聚乙二醇和任选的至少一种具有1000或更低的分子量的低分子量聚乙二醇，
-用于抑制细菌生长的防腐剂，
-缓冲剂，
-至少一种半胱天冬酶抑制剂，和
-任选的至少一种伯酰胺、仲酰胺或叔酰胺，
其中所述稳定化组合物的pH在>7至9.5的范围内，并且其中将所述稳定化组合物与所述尿液样品以选自1:3至1:10、优选1:5至1:8的体积比接触。


15.根据权利要求4至14中的一项或多项所述的方法，其中所述稳定化组合物具有以下特性中的一项或多项：
i)所述稳定化组合物稳定所述尿液样品中包含的细胞外DNA使其免于降解；
ii)所述稳定化组合物稳定所述尿液样品中脱落的有核细胞的细胞学、所述有核细胞内的基因组DNA和所述尿液样品中的细胞外DNA。


16.一种用于处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·格勒尔兹，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE