一种免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠吸附净化前处理联合HPLC‑UV法检测多种2,4‑二氨基嘧啶类药物残留的方法。本发明专利技术所述免疫磁珠前处理联合HPLC‑UV检测2,4二氨基嘧啶类药物残留量的方法，以制备的免疫磁珠作为特异性吸附材料进行动物肌肉样品的净化，并进一步建立其检测的HPLC‑UV方法，该方法的灵敏度高，操作简便，有机溶剂使用量少，定量分析结果可靠，适用于对动物食品中多种目标2,4二氨基嘧啶类药物的多残留检测和监控。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法
本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种基于免疫磁珠吸附净化前处理联合HPLC-UV法检测多种2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法。
技术介绍
2,4-二氨基嘧啶类药物，又称为抗菌增效剂，其与磺胺药等多种抗菌药物联用会呈现良好的协同效应，能够显著增强抗菌药的抑菌效果，甚至达到杀菌效应，被广泛应用于畜牧养殖业。目前，2,4-二氨基嘧啶类药物中，甲氧苄啶(TMP)、二甲氧苄啶(DVD)、奥美普林(OMP)和巴喹普林(BQP)已被批准应用于兽医临床，艾地普林(ADP)则处于开发阶段的动物专用抗菌增效剂。然而，超剂量使用兽药或药物过量残留存在对人和动物造成健康危害的风险。据报道，TMP可引起造血抑制和功能障碍，包括血红蛋白浓度和红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板数量的下降；DVD对哺乳动物细胞具有遗传毒性；BQP具有中枢神经系统毒性和肝毒性；OMP可能导致肌肉震颤，出汗和甲状腺增生；ADP可引起肝门区淋巴细胞浸润、肝细胞坏死和中枢神经系统毒性。为了人类健康及食品安全，许多国家和组织均对2,4-二氨基嘧啶类药物的最大残留限量(MRL)做出明确规定，要求不同动物或组织中的MRL为50μg/kg或100μg/kg。鉴于此，建立该类药物的有效残留监控方法则是保证动物食品安全的技术手段和技术保障。目前，有关2,4-二氨基嘧啶类药物残留检测的方法主要包括色谱方法和酶联免疫分析法。酶联免疫分析法灵敏度高、特异性强，适合于大批量样品的现场快速检测，但它作为半定量方法，检测结果的准确度不高，容易受多种因素影响，产生假阳性和假阴性结果。而色谱方法中，常用的包括高效液相色谱质谱法(HPLC)法和高效液相色谱质谱法(LC-MS)，其中，LC-MS的灵敏度和准确度高、检测特异性强、结果准确可靠，但需要昂贵的仪器设备；HPLC法虽具有检测结果可靠、仪器普及率高、检测成本低的优点，但检测的特异性不强，往往需要有效的样品净化步骤，如液液萃取、固相萃取等，需要消耗大量有机溶剂，检测的灵敏度低，且样品前处理过程繁琐，需要进行改进。免疫磁珠(immunomagneticbeads，IMBs)是由表面具有功能化基团的磁性微球与抗体偶合而成，由于其所偶联抗体的特异性，使得IMBs对靶分析物的吸附具有高度的特异性，有助于避免复杂基质的干扰，提高分析方法的特异性和灵敏度。同时，由于IMBs磁性微球的分散性好，在磁场作用下能快速聚集并与基质干扰分离，具有分离快速的优势，可有效简化样品净化过程，减少有机溶剂的大量使用。因此，基于免疫磁珠法进行样品的吸附净化因具有特异性强、操作简便、环境友好等优势而得到广泛的应用。目前，国内外尚未有基于免疫磁珠吸附净化处理联合HPLC-UV检测不同种类的2,4-二氨基嘧啶类药物残留的报道。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品的吸附净化的免疫磁珠，可实现2,4-二氨基嘧啶类药物样品的前处理；本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法；本专利技术所要解决的第三个技术问题在于提供一种基于免疫磁珠吸附净化前处理联合HPLC-UV法检测动物性食品中多种2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，该方法具有较好的特异性、简便性、时效性、灵敏性和可靠性。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠的制备方法包括将羧基化纳米磁珠(MBs)进行活化后，与抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体进行偶联反应的步骤，以及，将所述磁珠未结合位点进行封闭的步骤，即得。具体的，所述抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体优选为抗体14C6。具体的，所述可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠中：所述活化步骤为以EDS和NHS作为交联剂进行活化；优选的，所述磁珠：EDS：NHS的质量比为1：1.5-2：2-2.5，更优选为1mg：1.9mg：2.3mg。所述封闭步骤为以牛血清白蛋白进行封闭。优选的，所述羧基化纳米磁珠包括四氧化三铁纳米磁珠。优选的，所述偶联反应是在PBS缓冲液存在下进行的，所述PBS的最佳pH为7.0。优选的，所述偶联反应中，所述磁珠和抗体的质量比为100:6-10，最佳质量比为100:6，优选所述偶联反应温度为20-45℃，偶联反应时间≥2h。本专利技术还公开了一种基于所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法，包括如下步骤：(1)取待测样品加入碱化的提取试剂进行提取；(2)收集提取液并经氮气吹干，取残渣加入复溶试剂，离心并收集水相，得到待处理液；(3)向上述待处理液中加入权利要求1或2所述免疫磁珠，对靶分析物进行特异性吸附，反应结束后，经磁性分离磁珠，并加入洗脱试剂对所述磁珠吸附的靶分析物进行洗脱，收集洗脱液，即得所需待测溶液。具体的，所述待测样品为可食性动物产品，包括但不限于猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉。具体的，所述的基于所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法：所述步骤(1)中，所述提取试剂包括甲醇、二氯甲烷和/或乙腈；优选的，对于猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉样品而言，适宜的最佳提取溶剂分别为甲醇–二氯甲烷1:6(v/v)，甲醇–二氯甲烷6:1(v/v)，甲醇–二氯甲烷1:6(v/v)和乙腈；优选的，所述提取试剂的加入量为待测述动物样品量的1-10体积倍量；所述步骤(2)中，所述复溶试剂包括PBS缓冲液和正己烷的混合溶液，优选的，加入的PBS磷酸盐缓冲溶液的pH为4-8；所述步骤(3)中，所述洗脱试剂包括PBS缓冲液和甲醇的混合溶液，优选的，加入的PBS磷酸盐缓冲溶液的pH为4-8，甲醇水溶液浓度为80-100％，体积为250μL。具体的，所述步骤(3)中，所述免疫磁珠的吸附温度为20-45℃，吸附时间为30min-4h，优化为30min。本专利技术还公开了一种免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，包括按照所述方法制备所需待测溶液的步骤，以及，将所述待测溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分离检测的步骤。具体的，所述色谱分离检测步骤的条件包括：色谱柱：C18色谱柱；柱温：25-40℃；流动相：流动相A为0.01％氨水(v/v)，流动相B为体积比1：1的甲醇-乙腈溶液；流动相流速：0.5-1mL/min；检测波长：280-290nm；进样量：50μL；洗脱梯度为：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。具体的，所述免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，还包括制备拟合标准曲线的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括将羧基化纳米磁珠(MBs)进行活化后，与抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体进行偶联反应的步骤，以及，将所述磁珠未结合位点进行封闭的步骤，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括将羧基化纳米磁珠(MBs)进行活化后，与抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体进行偶联反应的步骤，以及，将所述磁珠未结合位点进行封闭的步骤，即得。


2.根据权利要求1所述可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠，其特征在于：
所述活化步骤为以EDS和NHS作为交联剂进行活化；
所述封闭步骤为以牛血清白蛋白进行封闭。


3.一种基于权利要求1或2所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取待测样品加入碱化的提取试剂进行提取；
(2)收集提取液并经氮气吹干，取残渣加入复溶试剂，离心并收集水相，得到待处理液；
(3)向上述待处理液中加入权利要求1或2所述免疫磁珠，对靶分析物进行特异性吸附，反应结束后，经磁性分离磁珠，并加入洗脱试剂对所述磁珠吸附的靶分析物进行洗脱，收集洗脱液，即得所需待测溶液。


4.根据权利要求3所述的基于所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述提取试剂包括甲醇、二氯甲烷和/或乙腈；
所述步骤(2)中，所述复溶试剂包括PBS缓冲液和正己烷的混合溶液；
所述步骤(3)中，所述洗脱试剂包括PBS缓冲液和甲醇的混合溶液。


5.根据权利要求3或4所述的基于所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述免疫磁珠的吸附温度为20-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立业，牛江秀，胡风欣，裴萌萌，贾礼，朱耀磊，马永杰，和朝军，杨玉民，张海宁，李朋收，
申请(专利权)人：洛阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41