一种制备1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵方法技术

本发明专利技术涉及一种制备1',4'‑反式‑ABA‑二醇的发酵方法。采用灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遗传改良菌株ZX2，通过二级发酵培养及培养基流加补料方法，可以维持菌株生长和合成产物需求的较好的碳氮比，获得较高产量的1',4'‑反式‑ABA‑二醇。本方法工艺简单易行，易于操作，适合工业化生产。本发明专利技术还提供了1',4'‑反式‑ABA‑二醇在作物栽培上的应用方法。

【技术实现步骤摘要】
一种制备1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵方法
本专利技术涉及微生物药物生物
，具体涉及1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵制备方法。
技术介绍
1′，4′-反式-ABA-二醇是真菌脱落酸(Abscisicacid，ABA)合成途径中的一种ABA的前体类似物，其化学式是C15H22O4。其化学结构见附图1。1967年Cornfor等曾报道过用化学合成1′，4′-反式-ABA-二醇酯的方法，1972年Walton等用Cornfor报道的方法合成了1′，4′-反式-ABA-二醇，并测试了其对菜豆离体胚轴的生长抑制效果，结果发现具有明显的生长抑制作用。1986年Hirai等从1.1L灰葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)培养基中分离到了6.0mgABA和1′，4′-反式-ABA-二醇的混合物，发现1′，4′-反式-ABA-二醇在B.cinerea体内可以转化为ABA，因此认为它是ABA的前体。1987年Okamoto和Vaughan等均在豌豆和鳄梨中发现了1′，4′-反式-ABA-二醇，也能在体内转化为ABA。1988年Okamoto等通过2H标记实验发现赤松尾孢霉(Cercosporapini-densiflorae)中1′，4′-反式-ABA-二醇可以合成ABA。而1989年Christopher等从氧标记的苹果果实中分离到ABA-醛和1′，4′-反式-ABA-二醇，认为1′，4′-反式-ABA-二醇可能是ABA的代谢产物。1995年Kettner等也发现灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)Bc6可以通过1′，4′-反式-ABA-二醇合成ABA。2004年Inomata也通过18O标记实验证实了1′，4′-反式-ABA-二醇是灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ABA的合成前体。2006年王天山等也从灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)中分离出1′，4′-反式-ABA-二醇的无色晶体，并通过X射线衍射分析确定了其单晶结构，本实验室将其作为农药的名称自命名为芷香二醇。由于ABA在植物生长调节中的重要作用，因此科学家也推测1′，4′-反式-ABA-二醇作为其前体类似物，可能也具有植物生长调节的功能。1972年，Walton等使用化学合成的14C标记的1′，4′-顺式-ABA-二醇和1′，4′-反式-ABA-二醇测试对菜豆离体胚轴的生长抑制效果：发现这两种物质均对菜豆离体胚轴的生长具有抑制作用，但效果稍低于ABA，推测这两种物质的生长抑制活性可能与其转化为ABA有关。2005年Asami等研究发现1′，4′-反式-ABA二醇的4′-甲氧基衍生物在水芹种子萌发和GA诱导的α-淀粉酶诱导试验中表现出与ABA相当水平的抑制活性，同时由于其结构特点使其不容易像ABA一样分解成红花菜豆酸类的物质而失活，因此具有成为植物生长调节剂的潜力。2005年，王天山等研究了灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)中1′，4′-反式-ABA二醇对稻谷种子的抑制活性，检测了其胚芽长抑制率、根长抑制率和根数抑制率，发现当浓度为0.5-5.0mg/L时，1′，4′-反式-ABA二醇具有明显的抑制种子萌发效果，，随着1′，4′-反式-ABA二醇浓度的增加，其抑制率也随之增强。虽然1′，4′-反式-ABA二醇具有成为植物生长调节剂的潜力，但其合成方法十分有限，可将ABA通过重氮甲烷处理将其转化为脱落酸甲酯，再通过NaBH4依次还原合成，这种化学方法要通过ABA作为前体，且操作复杂。而文献报道的从灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)菌体或者植物中提取的1′，4′-反式-ABA二醇含量很低，例如1995年Kettner等报道灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)Bc6在合成ABA的同时伴随有1′，4′-反式-ABA二醇的合成，1′，4′-反式-ABA二醇最高含量不超过100μg/gDW菌体，同时灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)Bc6浸染的植物叶片中1′,4′-反式-ABA二醇含量大约4μg/gDW。以这样的产量来说要通过化学合成或生物中提取的方法实现1′,4′-反式-ABA二醇的低成本规模化生产有很大困难，因此也限制了1′,4′-反式-ABA二醇的农业应用与机理研究。本实验室长期从事灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)代谢产物、发酵工艺技术研究。前期得到一株灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)TBC-10，已于2006年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.1889。我们对该灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)TBC-10进行遗传改良，获得了高产1′,4′-反式-ABA二醇的菌株，并研究了该菌株发酵生产工艺；通过该发酵生产工艺，可以获得较高产量的1′,4′-反式-ABA二醇，实现1′,4′-反式-ABA二醇的低成本规模化生产；并获得了1′，4′-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和植物抗逆诱导剂的应用方法。从而完成了本专利技术。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的之一，是提供一种用于生产1′，4′-反式-ABA-二醇(1′，4′-trans-diol-ABA)的新菌株；本专利技术的目的之二，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产1′，4′-反式-ABA-二醇；本专利技术的目的之三，是提供用于生产1′，4′-反式-ABA-二醇的培养基。本专利技术的目的之四，是提供1′，4′-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。更具体地说，是提供一种制备1′,4′-反式-ABA二醇的发酵方法，可大大提高合成1′,4′-反式-ABA二醇的效率，降低成本。包含以下步骤：将能够产生1′，4′-反式-ABA-二醇的丝状真菌，例如：孢霉菌属(Botryotinia)的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)，尾孢霉属(Cercospora)的赤松尾孢霉菌(C.pini-densiflorae)，或其它产生1′，4′-反式-ABA-二醇的真菌及其遗传改良菌株，在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基A)中培养，作为种子液；将种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液C)的补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集1′，4′-反式-ABA-二醇，并进行提取和纯化。本专利技术的具体实施方案是，采用已知的能够产生1′，4′-反式-ABA-二醇的丝状真菌，如：孢霉菌属(Botryotinia)的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)，尾孢霉属(Cercospora)的赤松尾孢霉菌(C.pini-densiflorae)，或其它产生1′，4′-反式-ABA-二醇的真菌及其遗传改良菌株，如灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)的遗传改良菌株等，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基A、B。在第二级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在23-26℃发酵培养12-72小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备1'，4'-反式-ABA-二醇(1'，4'-trans-diol-ABA)的发酵方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遗传改良菌株，在一级液体培养基A中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到第二级液体培养基B中培养，培养一段合适的时间后进行流加补料液C的补料发酵培养；发酵结束后，从发酵培养液中分离纯化出1'，4'-反式-ABA-二醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备1'，4'-反式-ABA-二醇(1'，4'-trans-diol-ABA)的发酵方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)遗传改良菌株，在一级液体培养基A中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到第二级液体培养基B中培养，培养一段合适的时间后进行流加补料液C的补料发酵培养；发酵结束后，从发酵培养液中分离纯化出1'，4'-反式-ABA-二醇。


2.1'，4'-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。


3.根据权利要求1，所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：灰葡萄孢霉(B.cinerea)遗传改良菌株为灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ZX2；其已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.17678。


4.根据权利要求1，所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法,其特征是：所述培养基A的组成质量百分比为：葡萄糖0.1-5.0％，牛肉膏0.1-1.0％，蔗糖0.1-5.0％，乳糖0.1-2.0％，KH2PO40.01-0.5％，MgSO40.01-0.2％，蛋白胨0.1-5.0％。


5.根据权利要求1，所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述培养基B的组成质量百分比为：








6.根据权利要求1，所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述的补料液C的组成质量百分比为：









成分
一般范围
优选范围

【专利技术属性】
技术研发人员：舒丹，钟娟，谭红，周金燕，杨杰，李哲敏，罗笛，陈东波，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51