一种多酶级联制备对香豆酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种多酶级联催化合成对香豆酸的方法。以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，然后通过脱水酶制备对香豆酸。本方法可以在管式反应器‑膜分离耦合装置中进行连续化生产，也可以在间歇反应釜法，羰基还原酶所需要的辅酶NAD(P)H通过葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应再生。每批羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、脱水酶均可回收利用5次以上，生产效率最高可达到50 g/L.h。本发明专利技术生产成本低、效率高、产品纯度好。

【技术实现步骤摘要】
一种多酶级联制备对香豆酸的方法
本专利技术涉及酶催化领域；更具体地说，是涉及一种多酶级联催化合成对香豆酸的方法。
技术介绍
对香豆酸(4-羟基肉桂酸或反式4-香豆酸，p-Coumaricacid，p-CA)，广泛存在于植物中，是白花蛇舌草、杜仲叶等植物的有效成分，具有预防心血管疾病、抗氧化等生物活性，是合成类黄酮、异黄酮、芪类等高价值保健品的中间体，如柚皮素、花青素、槲皮素、儿茶素、白藜芦醇、羟基酪醇和咖啡酸等；在农业行业用于植物生长促进剂；在食品行业用于长效杀菌剂和果蔬保鲜防腐剂。在化妆品行业由于对香豆酸对酪氨酸单酚酶和二酚酶均有抑制作用，所以添加到化妆品里抑制黑色素的生成。同时它也是重要的精细化工原料。通过降解反应生成对羟基苯甲酸；对香豆酸还可作为祛痰药杜鹃素、抗肾上腺素药物艾司洛尔等物质合成的中间体，还可以用于临床上治疗轻、中度老年痴呆的药物-加烂他敏的合成。因此寻找高效、绿色的对香豆酸及其衍生物制备方法已经成为国内外研究热点。目前，对香豆酸的制备主要有植物提取、化学合成和生物合成3种方法。其中植物提取存在植物生长周期长、收集半径大、萃取效率低等问题；化学合成则面临能耗高、反应时间长及环境污染等问题；而生物合成则具有低成本、高产率和绿色环保等优势，被认为是最有前景的生产方法。在生物合成方法中有酶催化法和从头合成法两种。其中，酶催化的专利有：(1)“一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法”，专利申请号为201911167675.4，该专利申请是以肉桂酸为原料，利用反式-肉桂酸-4-单加氧酶(EC1.14.14.91)进行催化合成，添加了还原型辅酶供体，价格十分昂贵，底物浓度可以达到100g/L，收率未报到。(2)“一种反式肉桂酸-4-羟基化酶及其编码基因与应用”，专利号为：201710136604，该专利技术利用石蒜属植物忽地笑的反式肉桂酸-4-羟化酶进行催化合成，该途径所有的羟化酶也是属于植物细胞色素P450酶EC1.14.14.91，但其产率仅为0.4g/L。微生物从头合成法：专利号为：201510411910，名称为“一种酵母菌的用途及天然对香豆酸的生产方法”公开了利用酵母细胞发酵发生产反式-4-香豆酸，产量可达10g/L左右。也有期刊文献报道利用酿酒酵母生物合成法对香豆酸的，合成产量仅仅达1.9g/L。上述方法均存在产率不高、酶源单一、制备成本高等问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种多酶级联制备对香豆酸的方法，本专利技术方法与上述方法均不同，以对羟基苯丙酮酸为原料，采用羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和脱水酶3种体外酶多酶级联耦合的方法，在管式反应器或间歇反应器中催化合成对香豆酸，反应体系简单，酶可以回收利用，辅酶可以原位再生，大大降低成本，提高产率。本专利技术的技术方案是，一种多酶级联制备对香豆酸的方法，以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，再通过脱水酶制备得到对香豆酸。进一步地，所述羰基还原酶还原过程中需要辅酶NAD(P)H，其采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应再生。更进一步地，该方法在管式反应器-膜分离耦合装置中进行连续化生产，即经过一级管式反应、一级超滤酶回收系统、二级管式反应和二级超滤酶回收系统实现连续化生产；或采用一个管式反应器或一个间歇反应釜，分步添加不同的酶实现对香豆酸的间歇化生产。再进一步地，该制备方法的具体步骤为：S1、第一级管式反应酶催化工序：在温度为20-40℃、pH为6-9条件下，添加对羟基苯丙酮酸、葡萄糖，羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行反应，反应时间为1-3小时；后进入第一级超滤酶回收工序；S2、第一级超滤酶回收工序：采用有机膜超滤设备对反应体系进行过滤，膜孔径为5-20kD；得到的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行回收至S1中循环利用；S3、第二级管式反应酶催化工序：S2中的渗透液进入通过第二级管式反应器内，在温度为15-35℃、pH为7-10条件下添加脱水酶进行反应，反应时间为1-3小时，后进入第二级超滤工序；S4、第二级超滤酶回收工序：采用有机膜超滤设备对S3所得反应体系进行过滤，膜孔径为30-50kD；得到的脱水酶回收至S3中循环利用；透过液进入结晶工序，结晶析出出对香豆酸，过滤，干燥得产品。进一步地，S1中，羰基还原酶为近平滑假丝酵母ATCC7330的羰基还原酶，利用重组菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-cpcr均质破碎制得。进一步地，S1中，羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶均以液体酶制剂形式加入；羰基还原酶液态酶制剂的添加量为对羟基苯丙酮酸底物的质量1-5％，葡萄糖脱氢酶的添加量为葡萄糖质量的2-6％。S1中优选反应温度为30℃，pH为7。进一步地，S1中，反应介质为双水相体系或者有机溶剂单相体系或者水/有机溶剂体系。有机溶剂为乙醇、异丙醇、丙酮等。进一步地，S2中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶回收5次以上，回收过程中根据需要补充相应的羰基还原酶和/或葡萄糖脱氢酶液体酶制剂。有机膜超滤设备水通量为70-110kg/h。进一步地，S3中提供脱水酶为产胞芽孢杆菌Clostridiumsporogenes的液体酶制剂的脱水酶，酶活为3000U/L,脱水酶液体酶制剂的添加量为对羟基苯基乳酸底物的质量的1-5％。进一步地，S4中脱水酶回收5次以上，回收过程中根据需要补充≤30％的脱水酶液体酶制剂；结晶时温度降低至-5-5℃。有机膜超滤设备水通量为70-110kg/h。经过羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶管式反应后，经过选用膜孔径5-20kD超滤设备，将酶和小分子产物分离，产物在透过液中进入脱水工序，酶液回收再利用，一般酶可以回收至少5次以上，酶活仍然有80％以上，第二次连续反应体系只需要补充20％左右的液态酶制剂。经过脱水后的产物和脱水酶经过超滤设备，采用40kD孔径大小的膜材料，水通量根据流量和压力确定。酶的回收次数可以达到5次以上，回收率达到70％以上，每次添加新鲜酶液不超过30％，透过液中含有对香豆酸，转化率以对羟基苯丙酮酸计算达到80％以上，其生产效率可以达到40g/L.h。本专利技术涉及的反应式为本专利技术采用多酶级联反应合成对香豆酸，以对羟基苯丙酮酸为原料，利用近平滑假丝酵母ATCC7330的羰基还原酶，采用第一级管式反应器在一定温度和pH条件下进行催化反应，其中通过葡萄糖脱氢酶进行NAD(P)H辅酶原位再生，生产对羟基苯基乳酸；然后通过超滤进行羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的回收利用，含有中间产物的透过液进入第二级管式反应器，利用产胞芽孢杆菌Clostridiumsporogenes的脱水酶对对羟基苯基乳酸进行脱水，反应结束后，通过二级超滤设备，实现脱水酶的回收利用，含有对香豆酸的透过液采用冷却结晶制备对香豆酸。具体流程图见图1。转化率以对羟基苯丙酮酸计算达到80％以上，生产效率可以达到30-50g/L.h；产品纯度达到99％以上，反应中的酶可以回收利用5～8次，生产成本低。附图说明图1为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多酶级联制备对香豆酸的方法，其特征在于：以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，再通过脱水酶制备得到对香豆酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种多酶级联制备对香豆酸的方法，其特征在于：以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，再通过脱水酶制备得到对香豆酸。


2.根据权利要求所述的方法，其特征在于：所述羰基还原酶还原过程中需要辅酶NAD(P)H，其采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应再生。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：该方法在管式反应器-膜分离耦合装置中进行连续化生产，即经过一级管式反应、一级超滤酶回收系统、二级管式反应和二级超滤酶回收系统实现连续化生产；或采用一个管式反应器或一个间歇反应釜，分步添加不同的酶实现对香豆酸的间歇化生产。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤为：
S1、第一级管式反应酶催化工序：在温度为20-40℃、pH为6-9条件下，添加对羟基苯丙酮酸、葡萄糖，羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行反应，反应时间为1-3小时；后进入第一级超滤酶回收工序；
S2、第一级超滤酶回收工序：采用有机膜超滤设备对反应体系进行过滤，膜孔径为5-20kD；得到的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行回收至S1中循环利用；
S3、第二级管式反应酶催化工序：S2中的渗透液进入通过第二级管式反应器内，在温度为15-35℃、pH为7-10条件下添加脱水酶进行反应，反应时间为1-3小时，后进入第二级超滤工序；
S4、第二级超滤酶回收工序：采用有机膜超滤设备对S3所得反应体系进行过滤，膜孔径为...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚大春，张书银，肖开兴，万里，宋婷，杨潇，任立伟，郭金玲，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42