TOMM40突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途技术

本发明专利技术涉及与LIMD相关的TOMM40突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途，突变TOMM40基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的一种：19号染色体物理位置为45397124的碱基由A突变为T、19号染色体物理位置为45404043的碱基由G突变为T；突变TOMM40基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的一种：c.523A>T、c.700G>T；突变TOMM40蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的一种：p.Lys175Ter、p.Glu234Ter。本发明专利技术为LIMD的早期分子筛查、家族遗传研究提供了重要的依据。

【技术实现步骤摘要】
TOMM40突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途
本专利技术涉及疾病相关突变基因，具体涉及TOMM40突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。
技术介绍
在所有遗传性代谢疾病中，线粒体疾病的发病率最高。线粒体主要负责氧化磷酸化产生三磷酸腺苷。线粒体疾病的发病机制涉及两种不同的基因组：核基因组和母体遗传的16.6kb线粒体基因组。线粒体疾病可由这些基因组中的任何一个突变引起的。核DNA(nDNA)的缺陷会导致诸如呼吸链复杂结构、翻译和线粒体DNA(mtDNA)修复缺陷等问题。在儿童时期诊断的线粒体疾病中，大约25％是由于线粒体DNA异常引起的，而其余75％是由于nDNA缺陷引起的。严重的新生儿或婴儿起病的线粒体疾病通常会导致出生后一年内死亡，婴儿致死性线粒体疾病(lethalinfantilemitochondrialdisease,LIMD)约占儿童期起病线粒体疾病病例的8.5％，但LIMD的分子遗传诊断率很低，大多数LIMD病例是在受试者死亡后通过生物化学和遗传方法才得到诊断。因此，当父母再次怀孕时，这类新生儿发病的严重线粒体疾病由于诊断不及时，还有可能再次发生。虽然已发现近千种核基因组基因与线粒体的功能有关，仅仅有少部分确定与LIMD的发生有关，提示存在新的LIMD致病基因有待挖掘。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的TOMM40突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白，所述突变TOMM40基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：19号染色体物理位置为45397124的碱基由A突变为T、19号染色体物理位置为45404043的碱基由G突变为T；所述突变TOMM40基因的cDNA序列与SEQIDNO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：c.523A>T、c.700G>T；所述突变TOMM40蛋白的序列与SEQIDNO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：p.Lys175Ter(175位赖氨酸突变为终止密码子)、p.Glu234Ter(234位谷氨酸突变为终止密码子)。TRANSLOCASEOFOUTERMITOCHONDRIALMEMBRANE40(线粒体外膜转位酶40，TOMM40)基因位于19号染色体19q13.32位置，该基因含有9个外显子，其编码的TOMM40蛋白有361个氨基酸，分子量约为40KDa。TOMM40是蛋白质前体定位到线粒体所必需的通道形成蛋白。TOMM40参与线粒体膜呼吸链NADH脱氢酶(ComplexI)的组装，与BCAP31形成复合物，介导复合物I组分从细胞质定位到线粒体。目前仅发现TOMM40的部分多态性位点与晚发型阿尔茨海默病的易感有关，但TOMM40致病变异与疾病的相关性未见报道。野生型TOMM40基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000130204，该基因位于19号染色体。专利技术人在大量正常人和LIMD患者家系中利用遗传学研究筛选发现TOMM40基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本专利技术提供了新的致病基因的致病突变位点，为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。上述第一种突变、第二种突变均位于翻译区，其中第一种突变的物理位置为45397124，碱基A突变为T；RNA水平：TOMM40基因的cDNA序列第523位碱基由A突变为T；蛋白水平：TOMM40基因编码蛋白第175位氨基酸由赖氨酸突变为终止密码子。第二种突变的物理位置为45404043，碱基由G突变为T，RNA水平：TOMM40基因的cDNA序列第700位碱基由G突变为T；蛋白水平：TOMM40基因编码蛋白第234位氨基酸由谷氨酸突变为终止密码子。一种检测突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括检测TOMM40基因或TOMM40蛋白中是否存在突变位点；突变位点为如下至少一种：Chr19(GRCh37):g.45397124A>T，cDNA序列发生c.523A>T，p.Lys175Ter(175位赖氨酸突变为终止密码子)；Chr19(GRCh37):g.45404043G>T，cDNA序列发生c.700G>T，p.Glu234Ter(234位谷氨酸突变为终止密码子)。在一些实施方案中，本专利技术中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。有些个体携带本专利技术的突变TOMM40基因但不患LIMD，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本专利技术提供的检测突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白的方法涉及检测杂合突变。但本专利技术提供的检测突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白的方法也包括检测纯合突变。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述检测突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白的方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤：TOMM40_E4F:ACTGAATGAGGTCTCTGCTTCTGTC(SEQIDNO:3)和TOMM40_E4R:TCACTCCTGCTGAGCCACTTCT(SEQIDNO:4)；TOMM40_E6F:GCTGGGCGATGGGTTAGGA(SEQIDNO:5)和TOMM40_E6R:GCGAAGGAGACGCTGGTGT(SEQIDNO:6)。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述采用引物进行扩增的PCR反应程序包括：94-100℃，1-10min；94-95℃，3-5min，95-96℃，25-30s，58-60℃，25-30s，循环30-40次，70-72℃，1-10min。检测突变TOMM40基因的方法包括如下步骤：(1)建立LIMD患者家系临床与遗传资源库，收集LIMD家系的临床信息与血液样本，提取基因组DNA；(2)设计覆盖TOMM40基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序；(3)比对正常人和LIMD患者家系样本的测序结果。在其中一种实施方式中，上述序列测定是Sanger序列测定。在其他实施方式中，上述检测突变TOMM40基因的方法还可以选自如下的技术进行：电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。在其他实施方式中，还涉及检测TOMM40基因外显子和外显子/内含子边界本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白，其特征在于：所述突变TOMM40基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：/n19号染色体物理位置为45397124的碱基由A突变为T、19号染色体物理位置为45404043的碱基由G突变为T；/n所述突变TOMM40基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：/nc.523A>T、c.700G>T；/n所述突变TOMM40蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：/np.Lys175Ter、p.Glu234Ter。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白，其特征在于：所述突变TOMM40基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：
19号染色体物理位置为45397124的碱基由A突变为T、19号染色体物理位置为45404043的碱基由G突变为T；
所述突变TOMM40基因的cDNA序列与SEQIDNO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：
c.523A>T、c.700G>T；
所述突变TOMM40蛋白的序列与SEQIDNO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：
p.Lys175Ter、p.Glu234Ter。


2.一种检测权利要求1所述的突变TOMM40基因或突变TOMM40蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于：所述方法包括检测TOMM40基因或TOMM40蛋白中是否存在突变位点，所述突变位点为如下至少一种：
Chr19(GRCh37):g.45397124A>T，cDNA序列发生c.523A>T，p.Lys175Ter；
Chr19(GRCh37):g.45404043G>T，cDNA序列发生c.700G>T，p.Glu234Ter。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤：
SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；
SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序包括：94-100℃，1-10min；94-95℃，3-5min，95-96℃，25-30s，58-60℃，25-30s，循环30-40次，70-72℃，1-10min。


5.一种检测突变TOMM40基因的试剂，其特征在于：所述试剂为核酸检测探针或引物；
所述核酸检测探针与...

【专利技术属性】
技术研发人员：王开宇，马鑫瑞，
申请(专利权)人：福州福瑞医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35