一株贝雷斯芽孢杆菌在水产品肝素提取中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一株提高水产品肝素提取率的贝雷斯芽孢杆菌（

【技术实现步骤摘要】
一株贝雷斯芽孢杆菌在水产品肝素提取中的应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株提高水产品肝素提取率的贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5及其应用。
技术介绍
肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的一种酸性粘多糖，具有较高含量的硫酸基，是已知负电荷密度最高的生物大分子，具有良好的抗凝血作用，是临床使用最广泛的抗凝血剂。近年来，有研究还发现肝素具有降血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用，是重要的粘多糖类生化药物之一。一般而言，肝素来源于猪、牛、羊的小肠黏膜提取物，也存在于动物的血管壁和肺之中，但由于受到肝素污染事件、疯牛病和宗教信仰的影响，陆地哺乳动物源肝素的开发受到限制，有学者提出从相对洁净的海洋生物中寻找肝素新资源以替代陆地动物原料。海洋占地球表面积的71%以上，庞大的生物库及其独特的环境，造就了其丰富的生物资源。近年来，从海洋生物中寻找肝素来源的替代原料的研究日益增多，已有报道从海湾扇贝、多种海藻和海洋细菌、虾、红树林蟹、金枪鱼、青口和文蛤等多种海洋生物中提取得到肝素。酶解法是提取肝素常用的方法之一。蛋白酶能够破坏肝素与蛋白质共价结合的糖肽键，从而将肝素从肝素-蛋白复合物中分离出来，也可将杂蛋白分解为小分子肽。最后通过调节pH，热变性和盐析除去酶蛋白和被降解的蛋白质制得肝素/类肝素。例如，专利CN201710419627.4公开了一种复合酶提取肝素的方法，通过使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶进行酶解提取肝素，并将提取液浓缩过滤后，使用树脂进行吸附，然后洗脱沉淀，干燥得到肝素钠粗品，再将所制得的肝素钠粗品经进一步精制后，得到高纯度的肝素钠产品，该方法从猪小肠粘膜中提取肝素，能够提高酶解效率，同时提高肝素钠粗品的产率。还有，专利CN200910071972.9公开了一种肝素的提取、分离、纯化方法，通过蛋白酶水解法、超声波辅助盐析法、离子交换树脂吸附法从猪小肠粘膜中分离和纯化肝素，该方法的肝素提取率达到了230.81mg/kg，比传统方法提高了40%。另有，专利CN201811378238.2公开了一种贝类肝素及其制备方法，其采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，通过酶解法从贝类中提取获得肝素。需要指出的是，不论是猪小肠粘膜还是贝类，都含有一定量的与蛋白质结合在一起的脂肪，上述方法均难以实现脂肪与蛋白质的彻底分离。而现有的酶解法提取肝素只关注蛋白的酶解，忽略了脂肪的酶解。这些脂肪的存在阻止了蛋白酶对蛋白的深度酶解，从而使得蛋白酶解的不彻底，影响了类肝素的提取率。现有技术中也未见报道能够解决此问题的方法，因此本专利专利技术人针对该问题进行深入的试验研究具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决采用现有技术无法实现蛋白与脂肪的分离，造成现有酶解法制备肝素提取率较低、成本较高的问题。基于本专利技术的上述意图，本专利的专利技术人筛选出一种可以实现降解脂肪与蛋白的芽孢杆菌菌株，通过生物形态和分子鉴定，所述芽孢杆菌菌株为贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60403，保藏送至日期为2018年7月2日。有关贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5的其它保藏信息参见其保藏存活证明。本专利的专利技术人证实，贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5为产脂肪酶与蛋白酶的芽孢杆菌，可以在低温下降解脂肪与蛋白。基于这一发现，本专利技术请求保护该芽孢杆菌菌株在肝素制备中的应用，所述菌株为贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5。根据
技术介绍
的记载，陆地动物和海洋生物均为肝素提取的来源，本专利技术分离鉴定的贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5在适宜条件下，可从海洋生物或陆地动物中制备所述肝素。作为贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5用于提取所述肝素的实施方式之一，本专利技术详细阐述了从海洋生物中的贝类肉体（或组织）提取所述肝素的步骤和方法。基于本专利技术的技术思路和启示，本领域普通技术人员结合现有技术，还可以将陆地动物作为所述肝素的来源物料，实现从陆地动物中获取所述肝素。具体地，本专利给出了将所述贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5接种于贝类肉浆，采用发酵法制备所述肝素的详实描述。进一步地，采用发酵法制备所述肝素的方法包括：培养所述菌种，得到种子液；向贝类肉浆中接种所述种子液；培养，加入葡萄糖继续培养发酵；发酵结束后，灭酶，得到制备所述肝素的原料。更进一步地，采用发酵法制备所述肝素的方法包括：将所述菌株接种于LB液体培养基中，于15℃、150r/min培养24h，得到种子液；收集所述种子液中的菌体，向贝类肉浆液中接种所述菌体，所述种子液与贝类肉浆液的体积比为5～15%；15℃、150r/min培养4～12h，加入葡萄糖继续培养发酵30～40h，葡萄糖的加入量为贝类肉浆液质量的0.2～5%；发酵结束后，沸水浴灭酶10min，冷却后离心，取上清液作为所述肝素提取和纯化的原料。本专利技术的贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5从土壤样品中分离得到，采用三丁酸甘油酯平板和脱脂牛奶平板筛选，得出其为一种产脂肪酶与蛋白酶的芽孢杆菌。有关贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5的分离鉴定和性能验证，本专利技术实施例中有详细的记载。本部分需要强调的是：鉴定所述贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5的引物采用细菌通用引物27F和1492R；鉴定菌株的PCR扩增体系为：27F1.5μL，1492R1.5μL，MightyAmpDNAPolymerase1.5μL，2×MightyAmpBuffer30μL，ddH2O25.5μL；PCR扩增反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃复性15s，68℃延伸90s，72℃延伸10min，从变性到第一次延伸过程循环40次。本专利的专利技术人进一步揭示，贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5将肉（组织）中的脂肪作为碳源加以利用，去除肉（组织）中的脂肪，实现蛋白与脂肪的分离，以促进蛋白酶与蛋白的深度酶解，从而使得肝素被充分释放出来，进一步提高肝素的提取率。由此，本专利技术提出，贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5用于提高从海洋生物中制备所述肝素的效率，进一步地，用于提高从贝类中制备所述肝素的效率。同理，基于本专利技术的技术思路和启示，本领域普通技术人员结合现有技术不难得出，贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5用于提高以陆地动物为物料制备所述肝素的效率。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果或优点包括：1）本专利技术分离鉴定了一种贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5，丰富了肝素制备的菌种资源；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株贝雷斯芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一株贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5，其特征在于，所述贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60403。


2.权利要求1所述贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5在水产品肝素提取中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其应用过程包括步骤：
（1）将所述贝雷斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HL-5接种于LB液体培养基中，于15℃、150r/min培养24h，得到种子液；
（2）将贝类去壳后采全肉，将贝肉与无菌水按照质量比为1:0.5～1:10的比例匀浆，并将得到的贝肉匀浆液加入到无菌三角瓶中；...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟赛意，刘唤明，刘寿春，洪鹏志，邓楚津，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44