一种特异性识别免疫分型为HLAA02的EBV病毒肽段的TCR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种特异性识别免疫分型为HLAA02的EBV病毒肽段的TCR引物组及其应用。本申请的引物组是根据HLAA02分型，EBV病毒抗原肽段FLYALALLL的TCR设计的包括位点为L2‑1、L2‑2、L2‑3、L2‑5、L2‑6、L2‑9、L2‑10、L2‑11、L2‑12、L2‑13、L2‑16、L2‑19、L2‑23、L2‑24和L2‑25TCR引物对中的一种或几种。本申请的引物序列如SEQ ID NO.1～30所示。本申请的引物组能特异性的识别HLAA02分型患者体内EBV病毒抗原肽段FLYALALL的TCR。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别免疫分型为HLAA02的EBV病毒肽段的TCR引物组及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种特异性识别免疫分型为HLAA02的EBV病毒肽段的TCR引物组及其应用。
技术介绍
EBV是可以感染人类的疱疹病毒家族的一员。EBV感染与某些类型的癌症有关。这些因EBV病毒感染所导致的癌症患者有望在TCR-T细胞治疗中获益。TCR-T细胞治疗是有望治疗实体肿瘤的新一代免疫细胞疗法。在TCR-T细胞治疗的过程中，需要不断监测被输注到病人体内的药用TCR-T细胞的生长和续存的情况。能实现此目的技术手段中，荧光定量PCR(qPCR)是检测灵敏度很高的技术手段。利用qPCR监测TCR-T细胞，需要针对TCR-T细胞的特定TCR基因序列设计qPCR引物。我公司克隆到了15条针对免疫分型为HLAA02的病人体内的EBV病毒蛋白肽段的FLYALALLL表位点的TCR，并对这15条TCR的基因序列申请了专利保护。但是现有技术中尚没有针对这15条TCR基因序列所设计的，能够监控TCR-T细胞在病人体内生长和续存状况的qPCR引物。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种特异灵敏的追踪TCR-T细胞药物的引物组，尤其涉及一种特异性识别免疫分型为HLAA02的EBV病毒肽段的TCR引物组及其应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种引物组，包括位点为L2-1、L2-2、L2-3、L2-5、L2-6、L2-9、L2-10、L2-11、L2-12、L2-13、L2-16、L2-19、L2-23、L2-24和L2-25TCR引物对中的一种或几种。作为优选，所述引物组依据HLAA02分型，EBV病毒抗原肽段FLYALALLL的TCR设计。作为优选，位点为L2-1的TCR引物对的序列如SEQIDNO.1～2所示；位点为L2-2的TCR引物对的序列如SEQIDNO.3～4所示；位点为L2-3的TCR引物对的序列如SEQIDNO.5～6所示；位点为L2-5的TCR引物对的序列如SEQIDNO.7～8所示；位点为L2-6的TCR引物对的序列如SEQIDNO.9～10所示；位点为L2-9的TCR引物对的序列如SEQIDNO.11～12所示；位点为L2-10的TCR引物对的序列如SEQIDNO.13～14所示；位点为L2-11的TCR引物对的序列如SEQIDNO.15～16所示；位点为L2-12的TCR引物对的序列如SEQIDNO.17～18所示；位点为L2-13的TCR引物对的序列如SEQIDNO.19～20所示；位点为L2-16的TCR引物对的序列如SEQIDNO.21～22所示；位点为L2-19的TCR引物对的序列如SEQIDNO.23～24所示；位点为L2-23的TCR引物对的序列如SEQIDNO.25～26所示；位点为L2-24的TCR引物对的序列如SEQIDNO.27～28所示；位点为L2-25的TCR引物对的序列如SEQIDNO.29～30所示。本专利技术还提供了所述的引物组在制备特异性检测HLAA02分型患者体内EBV病毒抗原肽段FLYALALLL的TCR产品中的应用。作为优选，所述产品为试剂盒产品。作为优选，所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。本专利技术提供了一种特异性识别免疫分型为HLAA02的EBV病毒肽段的TCR引物组及其应用，本专利技术的引物组依据HLAA02分型，EBV病毒抗原肽段FLYALALLL的TCR设计得到的。将本申请的引物组制备成荧光定量PCR试剂盒，追踪患者体内TCR-T细胞药物时，能特异的检测到药物的灵敏度为12个拷贝数的基因片段。附图说明图1为L2-1位点质粒DNA标准品的扩增曲线(从左到右质粒DNA标准品的稀释度分别为108拷贝、107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝的基因片段)。图2为L2-1位点质粒DNA标准品扩增产物的电泳图(从左到右质粒DNA标准品的稀释度分别108拷贝、107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝的基因片段)。图3为L2-1位点质粒DNA标准品的标准曲线图。图4为L2-1位点的TCR-T细胞药的基因组DNA的扩增曲线(从左到右，基因组DNA的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。图5为L2-1位点的TCR-T细胞药的基因组DNA扩增产物的电泳图(从左到右基因组DNA的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。具体实施方式本专利技术实施例中所述的TCR质粒标准品的构建方法为：(1)将每个位点对应的TCR基因片段克隆至SEQIDNO.31所示的质粒载体中，得到含有特定TCR基因片段的质粒载体；(2)将含有特定TCR基因片段的质粒载体在大肠杆菌内扩增，提纯质粒DNA，得到相应位点的TCR质粒标准品。在本专利技术实施例中以L2-1位点为例设计方案，其余位点的检测方法与之相同。在本专利技术实施例中所述的TCR-T细胞药的基因组DNA为从相应的TCR-T药物细胞中提取的基因组DNA。下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1引物设计依据HLAA02分型，EBV病毒抗原肽段FLYALALLL的TCR的L2-1、L2-2、L2-3、L2-5、L2-6、L2-9、L2-10、L2-11、L2-12、L2-13、L2-16、L2-19、L2-23、L2-24和L2-25位点设计引物对。得到的引物序列如SEQIDNO.1～30所示。实施例2标准曲线建立以TCR的L2-1位点为例设计方案。取L2-1位点的质粒DNA标准品的108个拷贝数稀释液、107个拷贝数稀释液、106个拷贝数稀释液、105个拷贝数稀释液、104个拷贝数稀释液、103个拷贝数稀释液、102个拷贝数稀释液、101个拷贝数稀释液，按照下述的反应体系和反应程序设置实时荧光PCR。反应体系：PCR预混液10μl；正向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；反向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；ROXReferenceDye(50×)0.2μl；TCR-T细胞药的基因组DNA2μl，浓度50ng/μl，或TCR的质粒标准品DNA2μl；Nuclease-FreeWater7μl；总反应体系共20μl。PCR反应程序：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，20s)40个循环。设置参比荧光为ROX，选择反应类型为SYBRGreenReagents，选择荧光检测通道SYBR，设置在60℃时采集荧光信号。经实时荧光PCR扩增得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组，其特征在于，包括位点为L2-1、L2-2、L2-3、L2-5、L2-6、L2-9、L2-10、L2-11、L2-12、L2-13、L2-16、L2-19、L2-23、L2-24和L2-25TCR引物对中的一种或几种。/n

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括位点为L2-1、L2-2、L2-3、L2-5、L2-6、L2-9、L2-10、L2-11、L2-12、L2-13、L2-16、L2-19、L2-23、L2-24和L2-25TCR引物对中的一种或几种。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组依据HLAA02分型，EBV病毒抗原肽段FLYALALLL的TCR设计。


3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，位点为L2-1的TCR引物对的序列如SEQIDNO.1～2所示；
位点为L2-2的TCR引物对的序列如SEQIDNO.3～4所示；
位点为L2-3的TCR引物对的序列如SEQIDNO.5～6所示；
位点为L2-5的TCR引物对的序列如SEQIDNO.7～8所示；
位点为L2-6的TCR引物对的序列如SEQIDNO.9～10所示；
位点为L2-9的TCR引物对的序列如SEQIDNO.11～12所示；
位点为L2-10的TCR引物对的序列如SEQIDNO.13～14所示；

【专利技术属性】
技术研发人员：张立峰，窦浪，贾杨彦圣，
申请(专利权)人：广东天科雅生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44