一种表达HPV 51L1的多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用制造技术

本发明专利技术提供一种表达HPV 51L1的多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用。利用该多核苷酸生产HPV 51L1蛋白具有高产量优势。该方法制备的HPV 51L1蛋白可以用于制备用于预防HPV 51感染的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种表达HPV51L1的多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用
本专利技术涉及一种生物
，涉及产生HPV51L1蛋白的方法，尤其涉及一种表达HPV51L1多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用。
技术介绍
人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)系无包膜的小型双链环状DNA病毒，属乳多空病毒科，乳头瘤空泡病毒A属成员。到目前为止，HPV病毒鉴定出的基因型已超过200种，其中至少有13种基因型的人类乳头瘤病毒持续感染后可能诱发癌变，被认为是高危HPV(high-riskHPV，hrHPV)。据国际癌症研究机构(InternationalAgencyofResearchonCancer，IARC)公布的数据，HPV-16,-18,-31,-33,-35,-39,-45,-51,-52,-56,-58,-59等基因型已被证实能够将被感染的细胞转化为恶性肿瘤细胞从而引发宫颈癌。[IARC.Biologicalagents:areviewofhumancarcinogenesis.IARCMonogrEvalCarcinogRisksHum2012；100B.]HPV的电镜观察形态为直径约60nm的球形，是由呈正二十面体对称的衣壳包裹一个含有约8000个碱基对的核酸组成的病毒颗粒。[Knipe,DM.,Howley,PM.Fieldsvirology.6th.Philadelphia,PA:WoltersKluwer/LippincottWilliams&WilkinsHealth；2013]病毒双链DNA基因组中只有一条链被用作转录模板，包含十个开放阅读框，编码三个基因组区域，包括编码6个病毒调控蛋白(E1，E2，E4，E5，E6和E7)的早期区域(earlyregion，E)，编码两种病毒衣壳蛋白L1和L2的晚期区域(lateregion，L)和调控病毒基因组复制、转录、翻译的长控制区(longcontrolregion，LCR)。目前已上市的预防性HPV疫苗的抗原成分主要为衣壳蛋白(L1)组成的病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLP)。VLP是利用基因工程手段表达的重组蛋白，即通过异源重组表达系统生产病毒衣壳蛋白，表达产物经纯化后获得不包含病毒核酸的、具有类似于天然病毒空间结构的病毒样颗粒。VLP由于缺少病毒遗传物质，不具备感染宿主的能力，但其接近于天然病毒结构的特性能激发机体产生有效的体液免疫及细胞免疫，起到预防感染和疾病的效果。用这种策略生产出的疫苗组分单一稳定、免疫原性强，具有较高的安全性。与世界卫生组织(WorldHealthOrganisation，WHO)合作的全球疫苗安全咨询委员会(GlobalAdvisoryCommitteeonVaccineSafety，GACVS)定期组织审查HPV疫苗相关的安全性数据，在2017年7月20日的最近一次审查中，他们对超过2.7亿剂接种后的数据进行汇总，得出的结论是：HPV疫苗是非常安全的，目前没有明显的证据表明HPV疫苗与任何严重副作用或重大医疗状况有关。[GACVS.SafetyupdateofHPVvaccines.https://www.who.int/vaccine_safety/committee/topics/hpv/June_2017/en/；2017.]大量研究表明HPV主要衣壳蛋白L1可在多种表达系统中表达，无需次要衣壳蛋白L2辅助即可组装成与天然HPV形态结构相似的病毒样颗粒。目前，有三家公司的预防性HPV疫苗已上市：葛兰素史克公司的二价疫苗(HPV16，18),默沙东公司的四价疫苗(HPV6，11，16，18)和九价疫苗9(HPV6，11，16，18，31，33，45，52，58)，以及厦门万泰沧海生物技术有限公司的二价疫苗(HPV16，18)。这三家公司分别采取昆虫细胞-杆状病毒表达系统、酿酒酵母表达系统和大肠杆菌表达系统进行HPVL1蛋白的制备，纯化后的抗原吸附佐剂后制备得到预防HPV感染的VLP疫苗。而HPV51作为能诱发宫颈癌等恶性肿瘤的高危型HPV，尚无利用汉逊酵母表达HPV51L1蛋白组装VLP的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达HPV51L1的多核苷酸及其表达载体、宿主细胞和应用。本专利技术一方面提供了一种用于编码HPV51L1蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，所述HPV51L1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术第二方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有如上所述多核苷酸。进一步地，所述重组表达载体是将如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列插入质粒中获得。所述质粒可以是实验室中常用的质粒，例如本申请实施例中提供的质粒为pMTZ。进一步地，所述重组表达载体还含有启动子和终止子。进一步地，所述启动子可以是pMOX，所述终止子可以为MOXTT。本专利技术的第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有或者整合有上述重组表达载体。进一步地，所述宿主细胞为酵母。优选的，所述酵母选自甲醇酵母。进一步优选的，为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。本专利技术第四方面提供了一种产生HPV51L1蛋白的方法，包括如下步骤：构建整合有或者含有核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的多核苷酸的重组汉逊酵母菌种，培养，收集菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，即可获得HPV51L1蛋白。进一步地，所述多核苷酸整合于质粒中，所述质粒整合于重组汉逊酵母菌种基因组中。进一步地，所述培养的条件包括：pH5.0～7.0，发酵温度37℃，搅拌转速≦950rpm，空气流量≦2.0VVM，罐压≦0.10MPa，溶氧10％以上。进一步地，将重组汉逊酵母菌种置于含有甘油的培养基中培养；在培养过程中，当培养基中的甘油消耗完，菌体湿重大于100g/L时，开始加甘油，甘油补料速度200～600g/h；当菌体湿重大于200g/L时，开始一次性加入甲醇至0.5％(w/v)，进入甲醇诱导期，待甲醇全部消耗且溶氧上升到80％时，开始流加甲醇，随着菌体利用甲醇速度加快，逐步调整甲醇流加速度，诱导过程控制溶氧20％以上，诱导30～50h菌体湿重达到300～400g/L后发酵结束；进一步地，所述分离纯化是指将菌体裂解液先通过阳离子层析柱，再通过层析柱CHT。进一步地，所述阳离子层析柱的交换层析填料为POROSHS或NanogelSP等。本专利技术第五方面提供HPV51L1蛋白，采用前述的产生HPV51L1蛋白的方法获得。本专利技术第六方面提供前述用于编码HPV51L1蛋白的多核苷酸，或重组表达载体，或宿主细胞，或HPV51L1蛋白在制备HPV疫苗中的用途。本专利技术第七方面提供一种抗HPV疫苗的制备方法，包括以下步骤：利用前述的产生HPV51L1蛋白的方法，制备HPV51L1蛋白，加入药学上可用的疫苗佐剂。...

【技术保护点】
1.一种用于编码HPV 51L1蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于编码HPV51L1蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQIDNO：2所示。


2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有如权利要求1所示多核苷酸。


3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有或者整合有如权利要求2所述重组表达载体。


4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为酵母；优选的，为甲醇酵母；更优选的，为多形汉逊酵母。


5.一种产生HPV51L1蛋白的方法，包括以下步骤：构建整合有或者含有核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的多核苷酸的重组汉逊酵母菌，培养，收集菌体，破碎菌体获得裂解液，分离纯化裂解液，即可获得HPV51L1蛋白。


6.根据权利要求5所述的产生HPV51L1蛋白的方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述多核苷酸整合于质粒中，所述质粒整合于重组汉逊酵母菌种基因组中；
2)所述培养的条件包括：pH5.0～7.0，发酵温度30～37℃，搅拌转速≦950rpm，空气流量≦2.0VVM，罐压≦0.10MPa，溶氧10％以上；
3)将重组汉逊酵母菌种置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅文彬，丁珊，万平，张计乾，
申请(专利权)人：上海博唯生物科技有限公司，重庆博唯佰泰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31