作为抗腹泻疫苗抗原的热稳定肠毒素突变体制造技术

本发明专利技术涉及具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：NSSNYCCELCCNPACTGCY，其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N和L9T，且第二突变为A14T。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为抗腹泻疫苗抗原的热稳定肠毒素突变体
本专利技术涉及针对产肠毒素性大肠杆菌(Escherichiacoli)(ETEC)的疫苗。更具体而言，本专利技术涉及适合用作疫苗组分的ETEC热稳定肠毒素的突变体。
技术介绍
产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)(一种革兰氏阴性菌)感染是中低收入国家(LMIC)中，5岁以下儿童中的腹泻有关病和死亡的主要原因之一。这些非常常见的感染估计每年引起约25,000名儿童死亡，并且促成儿童营养不良。此外，ETEC是留在ETEC流行地区的游客和军事人员中腹泻的首要原因。全球与ETEC感染相关的死亡正在下降；然而，发病率仍然很高。值得注意的是，经反复腹泻发作而存活的儿童具有长期后遗症的较高风险，包括认知发育受损、生长迟缓和肥胖。总体而言，ETEC感染的这些短期和长期负面影响强调了对于有效干预的需要。参见：ZegeyeED，GovasliML，SommerfeltH，PuntervollP.DevelopmentofanenterotoxigenicEscherichiacolivaccinebasedontheheat-stabletoxin.HumVaccinImmunother.2018Aug6:1-10.doi:10.1080/21645515.2018.1496768.[提前发布的Epub]PubMedPMID:30081709。ETEC定殖小肠，并且通过粪-口途径传播。细菌经由特征性定居因子(CF)粘附至肠上皮。CF是菌毛或纤丝–存在于细菌表面上的丝状蛋白质。迄今为止，已鉴定了25种不同的ETECCF(Rivera等人，JClinMicrobiol.2010年9月；48(9):3198–3203)。除CF之外，称为热稳定(ST)和热不稳定(LT)毒素的肠毒素也是ETEC腹泻中的毒力决定因素。两种毒素均通过刺激离子和水经由肠上皮细胞的净分泌来起作用。这引起水样腹泻，其在最极端的情况下可以导致霍乱样状况。ST在20世纪80年代初被鉴定为ETEC疫苗的靶，尽管多次尝试，但尚未成功开发出基于ST的疫苗。三个主要问题是难以将ST用作疫苗组分的原因。首先，ST多肽是固有地毒性的。其次，ST多肽以其天然形式是非免疫原性的。最后，ST紧密类似于内源性多肽鸟苷素和尿鸟苷素，其增加了抗热稳定毒素抗体可能交叉反应，并且引起疫苗接种者中的自身免疫反应的可能性。猪和人ST(STp和STh)是广泛覆盖率ETEC疫苗的寻找中的目的抗原。由于其固有的毒性以及与鸟苷素和尿鸟苷素的相似性(图1)，当考虑将ST作为抗原时，毒素类似物是唯一的选项。ST突变体已在本领域中得到公开，参见例如Taxt，A.等人Infect.Immun.78，1824-1831(2010)；Zhang等人(2010)InfectionandImmunity78(1):316-325；Liu，M.等人Toxins3，1146-1162(2011)；WO2010/048322；Okamoto等人(1988)Infectionandimmunity56(8):2144-2148；Yamasaki等人(1990)Bull.ChemSocJpn63:2063-2070；WO2005/087797；WO2007/022531；WO2014/128555；WO2011/156453。几种ST突变体已报告为降低毒性(Taxt，A.等人Infect.Immun.78，1824-1831(2010)和Liu，M.等人Toxins3，1146-1162(2011)。在此背景下，选择的STh单一突变体和双重突变体已成为首要候选ST类毒素(Taxt，A.M.等人，Towardsrationaldesignofatoxoidvaccineagainsttheheat-stabletoxinofEscherichiacoli，InfectImmun，2016，84，1239-1249)。然而，由于ST是小多肽，当与载体偶联时，大多数毒性降低的突变体也可能具有降低的抗原性和免疫原性。WO2014/128555讨论了具有降低毒性的ST突变体。提供既显示出降低的毒性又引发能够中和天然ST的抗体的ST突变体的问题是一个挑战。提供这样的ST突变体的问题仍然是一个重大挑战，所述ST突变体显示出降低的毒性、当与载体偶联时的特异性免疫原性以及降低的交叉反应性。
技术实现思路
STh和STp分别是包括三个二硫键的19和18氨基酸肽(图1)。具有三个二硫键的肽的重组表达和化学合成均为挑战性的。正确的半胱氨酸配对对于抗原性是至关重要的，并且因此对于免疫原性也是至关重要的。尽管STh和STp可以在直接氧化折叠后，作为重组肽或化学合成肽生产，但其类似物的制备仍是挑战性的，尤其是考虑到大量各种可能的异构体。在此背景下，本申请：(i)报告了ST突变体，特别是ST双重突变体，其包括内部突变(例如赖氨酸和/或苏氨酸，或包括与正交缀合相容的取代的氨基酸类似物)，特别是在SEQIDNO:1的位置9和/或14或SEQIDNO:2的位置8和/或13处。(ii)公开了可能例如在其N末端处修饰的ST双重突变体的不同类似物的化学合成。(iii)例证了“正交化学策略”，其依赖于彼此正交的三组硫醇保护基团的组合，确保非天然的ST类似物根据期望进行折叠，无论是需要天然折叠还是非天然折叠。(iv)公开了与其链内位点选择性锚定相容的ST类似物，拓宽了作为疫苗、免疫原、诊断工具应用的潜力。(v)显示了双重突变体AcL9KA14T和L9GA14T和AcL9GA14K是STh的无毒抗原模拟物。(vi)公开了ST类毒素-蛋白质缀合物，由此ST在肽链内部的单个位点附着至载体。(vii)公开了基于与常规基于戊二醛的化学不同的缀合过程，化学合成的免疫原性ST类毒素-蛋白质缀合物。(viii)公开了基于硫醇-马来酰亚胺缀合过程或点击化学，化学合成的免疫原性ST-蛋白质缀合物。(ix)显示了双重突变体L9KA14T引发中和抗体，并且存在低交叉反应性或无交叉反应性。如本文使用的，术语“L9KA14T”可与术语“L9K/A14T”和“L9K-A14T”互换。本专利技术人已显示了，A14T突变是解毒突变，其持续地引发中和天然STh的抗体。然而，ST的一些突变可能导致不需要的免疫优势新表位。实际上，专利技术人已发现，与A14T不同，A14H突变形成免疫优势的新表位，并且A14H突变体引发与天然毒素弱反应的抗体。专利技术人还已显示了，与尿鸟苷素共享的L9是共享表位中的中心残基，其可以引发交叉反应抗体(Taxt，A.M.等人，Towardsrationaldesignofatoxoidvaccineagainsttheheat-stabletoxinofEscherichiacoli，InfectImmun，2016，84，1239-1249)。为了破坏该共享表位，专利技术人已使L9残基突变。在一种形式中，引入了L9K突变。为了避免赖氨酸残基形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：/nNSSNYCCELCCNPACTGCY/n其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N和L9T，且第二突变为A14T。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180824 EP 18306137.31.一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：
NSSNYCCELCCNPACTGCY
其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N和L9T，且第二突变为A14T。


2.根据权利要求1的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L9K和A14T。


3.根据权利要求1的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L9N和A14T。


4.根据权利要求1的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L9T和A14T。


5.一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：
NTFYCCELCCNPACAGCY
其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N和L8T，且第二突变为A13T。


6.根据权利要求5的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L8K和A13T。


7.根据权利要求5的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L8N和A13T。


8.根据权利要求5的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L8T和A13T。


9.一种用于产生大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体，优选根据权利要求1至4中任一项的突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(tBu)；对于N使用Trt或Dmcp；对于K使用叔丁氧羰基(Boc)，对Fmoc-AA进行侧保护；并且其中通过在位置7和15处引入Fmoc-Cys(Trt)-OH、在位置10和18处引入Fmoc-Cys(Acm)-OH、以及在位置6和11处引入Fmoc-Cys(Mob)-OH，对半胱氨酸(C)进行序贯地正交侧保护。


10.一种用于产生大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体，优选根据权利要求5至8中任一项的突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(tBu)；对于N使用Trt或Dmcp；对于K使用叔丁氧羰基(Boc)，对Fmoc-AA进行侧保护；并且其中通过在位置6和14处引入Fmoc-Cys(Trt)-OH、在位置9和17处引入Fmoc-Cys(Acm)-OH、以及在位置5和10处引入Fmoc-Cys(...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·蓬特沃尔，F·巴勒克斯，YM·科瓦，Y·迪亚茨，M·A·G·拉森，L·穆拉尔，A·塔克斯特，E·D·策格耶，S·S·维斯韦斯瓦里亚，V·米什拉，A·巴尔曼，
申请(专利权)人：挪威西部创新股份有限公司，
类型：发明
国别省市：挪威;NO