一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组制造技术

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD‑RMA法检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，包括检测非洲猪瘟病毒的引物对及对应的探针，所述探针的5’端用FAM标记，探针的第33个碱基T替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3‑spacer修饰；所述下游引物的5’端用Biotin标记；扩增产物大小不超过500bp。本发明专利技术提供的LFD‑RMA法特异性强、灵敏度高、检测周期短、无需特殊仪器、等温即可反应，可以作为有效的非洲猪瘟现场检测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组
本申请属于生物检测
，具体为一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组。
技术介绍
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒，属于非洲猪瘟病毒科，是一种巨大且复杂的双链DNA病毒。ASFV不感染人，不会对公共卫生造成直接危害，但是严重危害着养猪产业，造成巨大经济损失。由于非洲猪瘟具有高度的传染性，除了伴有发热和出血的临床症状以外，可对不同日龄的猪群造成95%至100%的死亡率，因此世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。目前非洲猪瘟疫苗仍在实验室研究阶段，具有普遍保护性的疫苗还没有上市。因此，通过诊断方法对其进行监控和控制，是目前至关重要的控制方法。ASFV的实验室诊断有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、免疫电泳试验、荧光定量PCR等方法。这些方法耗时长，操作复杂，对操作人员的技术要求高，不适用与非洲猪瘟病毒的快速检测。而重组酶介导扩增（RecombinaseMediatedAmplification,RMA）技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37-42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现核酸的快速扩增。RMA技术可以与侧流免疫层析技术（LFD）相结合进行扩增产物的检测。在RMA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团约30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer），该位点可被核酸内切酶IV（nfo酶）识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RMA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。本专利技术采用LFD-RMA法建立快速检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法，为非洲猪瘟病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，包括检测非洲猪瘟病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：ASFV-F（上游引物）：5’-CCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA-3’;ASFV-R（下游引物）：5’-[Biotin]GTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAA-3’;ASFV-P（探针）：5’-[FAM]TCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCG[dSpacer]TAACAACATGTCCGA[C3-spacer]-3’。优选的，所述探针的5’端用FAM标记，探针的第33个碱基T替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；所述下游引物的5’端用Biotin标记；扩增产物大小不超过500bp。一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸内切酶IV。所述缓冲液含有下述组分：Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10µM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10%w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/µL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/µL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/µL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/µL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/µL。所述标准阳性质粒为含有ASFV基因片段的重组质粒，用于ASFV核酸检测的阳性对照。所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。所述试剂盒可以检测的样品为全血或内脏组织。一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样本的DNA；（2）设计用于ASFV检测的引物对及探针；（3）以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；（4）应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有ASFV；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有ASFV。有益效果：本专利技术将重组酶介导的核酸恒温扩增技术与侧流层析技术相结合，提供一个简单、快速、不须昂贵设备即可现场进行ASFV的筛检方式。无需热循环反应及特殊的仪器，其检测结果可通过目测直接观察，具有高灵敏度、特异性的特点，适用于即时快速诊断，可在非实验室环境下进行筛检，可提供非洲猪瘟病毒的快速检测。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1LFD-RMA法检测ASFV的灵敏性试验；图2LFD-RMA法检测ASFV的特异性试验；图中序号代表：1：1×105copies/μL；2：1×104copies/μL；3：1×103copies/μL；4：1×102copies/μL；5：1×101copies/μL；6：1copies/μL。具体实施方式为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。实施例11、阳性标准质粒的制备提取ASFV的核酸作为模板，对ASFV的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，其特征在于，包括检测非洲猪瘟病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：/nASFV-F(上游引物)：/n5’-CCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA-3’；/nASFV-R(下游引物)：/n5’-[Biotin]GTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAA-3’；/nASFV-P(探针)：/n5’-[FAM]TCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCG[dSpacer]TAACAACATGTCCGA[C3-spacer]-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，其特征在于，包括检测非洲猪瘟病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
ASFV-F(上游引物)：
5’-CCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA-3’；
ASFV-R(下游引物)：
5’-[Biotin]GTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAA-3’；
ASFV-P(探针)：
5’-[FAM]TCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCG[dSpacer]TAACAACATGTCCGA[C3-spacer]-3’。


2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，其特征在于，所述探针的5’端用FAM标记，探针的第33个碱基T替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；所述下游引物的5’端用Biotin标...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，陈龙，张瑶，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37