一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT‑PCR检测方法，该引物组由发明专利技术人根据GenBank公布的BVDV‑1和BVDV‑2流行毒株5'‑UTR保守序列，设计2组特异性引物，所得目的基因扩增片段大小分别为279bp和180bp。建立的BVDV双重RT‑PCR不与牛传染性鼻气管炎病毒等发生交叉反应，可用于了解样品采集地牛群BVDV的感染情况，建立的BVDV双重RT‑PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本发明专利技术建立的双重RT‑PCR方法检测了我国2017‑2020年西部4个不同省(直辖市)不同牛场的总共1154份田间样品，结果显示389份预混样品中BVDV‑1阳性率为8.48％，BVDV‑1阳性率为9.51％，BVDV‑1+BVDV‑2阳性率为2.83％，具有一定临床应用价值，可用于临床BVDV的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法
本专利技术涉及兽医分子生物学检测
，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)是引起牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)又称粘膜病(Mucosaldisease，MD)的主要病原，宿主动物可出现腹泻、急慢性黏膜感染、繁殖和免疫障碍，同时伴有其他病原的继发感染与混合感染。耐过犊牛则成为持续感染动物(PI)，PI牛终生带毒且不断向外排毒，成为BVDV的重要传染源，难以净化，给养牛业的安全生产带来了严重的挑战。BVDV是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，BVDV主要分为2种基因型，即BVDV-1型和BVDV-2型。BVDV-1型的主要症状为一过性发热、腹泻和急慢性粘膜病。BVDV-2型的症状主要表现为发烧、腹泻、呼吸失调和血小板减少等，主要导致奶牛流产，对牛的致死性较高。近年来，BVDV-1型和BVDV-2型均在我国被报道，两个基因型间具有一定交叉保护作用，但无法达到高效保护。目前，检测BVDV-1型和BVDV-2型的PCR方法已有研究报道，但其先对病毒RNA进行逆转录，再进行PCR扩增，操作较为繁琐，极易造成气溶胶污染。因此，急需一种一步法快速分型鉴别方法来区分牛群中BVDV-1型和BVDV-2型感染，为疫病防控提供技术支持。r>
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中指出的不足，本专利技术根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计一组(4条)特异性引物，提供了一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，旨在解决上述
技术介绍
中现有技术存在的问题。本专利技术采用以下技术方案：一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，该方法包括以下步骤：(1)引物设计与合成根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计4条特异性引物，所述引物的基因序列如下：BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3',(2)样品处理及核酸提取采集牛腹泻粪便和血清样品若干份，使用核酸提取试剂盒提取样品的核酸RNA；(3)阳性质粒的制备以BVDV-1和BVDV-2基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列，与pMD19-T载体进行重组质粒的构建；(4)RT-PCR扩增反应以P1、P2、P3、P4为引物，对构建的重组质粒进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增反应体系为：2×Onestepbuffer缓冲液10μL、OnestepEnzymeMix混合液0.5μL、10mmol/L引物P10.5μL、10mmol/L引物P20.5μL、10mmol/L引物P30.5μL、10mmol/L引物P40.5μL、模板1.0μL、补加双蒸水至20μL。扩增程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；进行30个循环；72℃延伸10min。扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。上述检测方法，当扩增片段大小为279bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒1型；当扩增片段大小为180bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒2型；当扩增片段同时出现279bp和180bp大小，则样本为牛病毒性腹泻病毒1型和2型混合感染。本专利技术公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分型的一步法双重RT-PCR检测方法，该引物组由专利技术人根据GenBank公布的BVDV-1和BVDV-2流行毒株5'-UTR保守序列，设计2组特异性引物，所得目的基因扩增片段大小分别为279bp和180bp。建立的BVDV双重RT-PCR不与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)和猪瘟病毒(CSFV)发生交叉反应，可用于了解样品采集地牛群BVDV的感染情况，经敏感性和特异性检测分析表明建立的BVDV双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本专利技术建立的双重RT-PCR方法检测了我国2017-2020年西部4个不同省(直辖市)不同牛场的总共1154份田间样品，结果显示389份预混样品中BVDV-1阳性率为8.48％，BVDV-1阳性率为9.51％，BVDV-1+BVDV-2阳性率为2.83％，具有一定临床应用价值，可用于临床BVDV的检测。附图说明图1是本专利技术实施例提供的BVDV-1单重RT-PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2重组质粒混合物；4：阴性ddH2O对照。图2是本专利技术实施例提供的BVDV-2单重RT-PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2重组质粒混合物；4：阴性ddH2O对照。图3是本专利技术实施例提供的BVDV双重RT-PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2重组质粒混合物；4：阴性ddH2O对照。图4是本专利技术实施例提供的BVDV双重RT-PCR特异性检测结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒；2：BVDV-2重组质粒；3：BVDV-1和BVDV-2重组质粒混合物；4：IBRV；5：BRV；6：BCV；7：BPIV3；8：CSFV；9：阴性ddH2O对照。图5是本专利技术实施例提供的BVDV-1单重RT-PCR敏感性检测结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-1重组质粒10-1稀释；2：BVDV-1重组质粒10-2稀释；3：BVDV-1重组质粒10-3稀释；4：BVDV-1重组质粒10-4稀释；5：阴性ddH2O对照。图6是本专利技术实施例提供的BVDV-2单重RT-PCR敏感性检测结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：BVDV-2重组质粒10-1稀释；2：BVDV-2重组质粒10-2稀释；3：BVDV-3重组质粒10-3稀释；4：BVDV-4重组质粒10-4稀释；5：BVDV-4重组质粒10-5稀释；6：阴性ddH2O对照。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n(1)引物设计与合成/n根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计4条特异性引物，所述引物的基因序列如下：/nBVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，/nP2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，/nBVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，/nP4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3'，/n(2)样品处理及核酸提取/n采集牛腹泻粪便和血清样品若干份，使用核酸提取试剂盒提取样品的核酸RNA；/n(3)阳性质粒的制备/n以BVDV-1和BVDV-2基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列，与pMD19-T载体进行重组质粒的构建；/n(4)RT-PCR扩增反应/n以P1、P2、P3、P4为引物，对构建的重组质粒进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增反应体系为：2×One step buffer缓冲液10μL、One step Enzyme Mix混合液0.5μL、10mmol/L引物P1 0.5μL、10mmol/L引物P2 0.5μL、10mmol/L引物P3 0.5μL、10mmol/L引物P4 0.5μL、模板1.0μL、补加双蒸水至20μL；扩增程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；进行30个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重RT-PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
根据BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因组序列5'-UTR序列设计4条特异性引物，所述引物的基因序列如下：
BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，
P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，
BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，
P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3'，
(2)样品处理及核酸提取
采集牛腹泻粪便和血清样品若干份，使用核酸提取试剂盒提取样品的核酸RNA；
(3)阳性质粒的制备
以BVDV-1和BVDV-2基因组5'端非编码区(5'-UTR)分别为目的序列，与pMD19-T载体进行重组质粒的构建；
(4)RT-PCR扩增反应
以P1、P2、P3、P4为引物，对构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧云文，王勤，刘俐君，
申请(专利权)人：开江县动物疫病预防控制中心，达州职业技术学院，
类型：发明
国别省市：四川;51