一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建pET30a‑PPV6‑VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni‑NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)

【技术实现步骤摘要】
一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法。
技术介绍
猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，是一种自主复制型病毒，是造成母猪繁殖障碍性疫病的主要病原体之一；母猪感染该病毒后可导致流产、木乃伊胎及死胎等，其给国内外养猪业造成了严重的经济损失；Mary与Mahncl在1966年首次发现了该病毒，而后发展到世界多个国家和地区；在20世纪80年代，我国的多个地方都分离发现猪细小病毒病。目前，随着分子生物学诊断技术的发展，PPV2、PPV3、PPV4、PPV5和PPV6等几个新型猪细小病毒已被发现，这几个新型的PPV在基因组方面，尤其是在VP2基因方面存在较大差异性。2014年Ni等利用序列无关单引物扩增(SISPA)的方法，在中国的流产猪胎儿中发现了一种新型的细小病毒，命名为Porcineparvovirustype6，即PPV6。PPV为单股线状DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，基因组全长约为5kb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n(1)引物设计与合成/n(2)重组表达载体构建及鉴定/n(3)重组VP2蛋白诱导表达、纯化、鉴定及浓缩/n(4)高免血清制备/n(5)抗体纯化、脱盐、鉴定/n(6)抗体浓缩、过滤除菌及分装。/n

【技术特征摘要】
1.一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
(2)重组表达载体构建及鉴定
(3)重组VP2蛋白诱导表达、纯化、鉴定及浓缩
(4)高免血清制备
(5)抗体纯化、脱盐、鉴定
(6)抗体浓缩、过滤除菌及分装。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PCR扩增引物为1对，即P1、P2，扩增片段大小为981bp；
所述引物的基因序列如下：
P1：5'-CAGGATCCAGACCCCTTGGTGCTATT-3'，下划线为BamHI酶切位点；
P2：5'-GCCTCGAGCACTCCAGGGTTCCAGAT-3'，下划线为XhoI酶切位点。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：制备猪细小病毒6型VP2蛋白免疫原的过程为：
(a)构建pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，PCR、双酶切和测序鉴定重组质粒；
(b)阳性克隆菌于37℃、1mmol/LIPTG诱导表达6h，表达菌液超声破碎，12000r/min离心收集上清裂解液，表达蛋白Ni-NTA树脂亲和层析纯化，SDS-PAGE分析，Westernblot鉴定，重组VP2蛋白大小为40kD；
(c)纯化后蛋白液依次在8M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素、PBS液中进行透析复性，每次透析时间为6h，5000r/min超滤浓缩；
(d)按照免疫剂量，将纯化后复性VP2蛋白与弗氏佐剂1:1混匀乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧云文，潘琴，张杰，王勤，刘俐君，代军飞，石义成，任绍科，邓书明，
申请(专利权)人：开江县动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：四川;51