一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建pET30a‑PPV6‑VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni‑NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)

【技术实现步骤摘要】
一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法。
技术介绍
猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，是一种自主复制型病毒，是造成母猪繁殖障碍性疫病的主要病原体之一；母猪感染该病毒后可导致流产、木乃伊胎及死胎等，其给国内外养猪业造成了严重的经济损失；Mary与Mahncl在1966年首次发现了该病毒，而后发展到世界多个国家和地区；在20世纪80年代，我国的多个地方都分离发现猪细小病毒病。目前，随着分子生物学诊断技术的发展，PPV2、PPV3、PPV4、PPV5和PPV6等几个新型猪细小病毒已被发现，这几个新型的PPV在基因组方面，尤其是在VP2基因方面存在较大差异性。2014年Ni等利用序列无关单引物扩增(SISPA)的方法，在中国的流产猪胎儿中发现了一种新型的细小病毒，命名为Porcineparvovirustype6，即PPV6。PPV为单股线状DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，基因组全长约为5kb，含有2个主要的开放阅读框(ORF)，其中ORF1编码3个非结构蛋白NS1、NS2、NS3；ORF2编码2个结构蛋白VP1、VP2，VP2可进一步水解为VP3。PPV6与其他细小病毒亚族成员基因序列同源性为20.5％-42.6％，与PPV4的关系最亲密。PPV6基因组全长约为6136bp，G+C含量为46.7-47.1％，其基因组结构与传统细小病毒相似，ORF1编码由622个氨基酸构成NS蛋白，ORF2编码由1189个氨基酸构成VP蛋白。VP蛋白大小约为132kD，大于绝大多数细小病毒。组成核衣壳的主要结构蛋白是VP2，其分子大小约为64kD，由579个氨基酸构成，VP2具有良好的抗原性，在病毒的致病性方面起着重要重要，并且可以诱导动物机体产生保护性免疫反应。目前有学者采用真核表达系统、杆状病毒系统等对VP2蛋白进行诱导表达，但其蛋白表达量较低，且不便于培养。大肠埃希菌表达载体作为非常成熟的表达载体，其拥有得天独厚的技术优势。单克隆抗体只有一个克隆位点，其只能识别某一特定的抗原表位，具有较高的特异性和灵敏度。多克隆抗体作为重要的免疫诊断材料，其与单克隆抗体相比具有独特的优势，能识别多个抗原表位，即使少数几个抗原表位被破坏或抗原构象改变，实验结果也不受影响；且制备方法较便、成本较低。
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中指出的不足，本专利技术根据PPV6流行毒株(GenBank：KX384821.1、MH820262.1、MH447540.1和MK378402.1)基因组序列设计2条特异性引物，提供了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，旨在解决上述
技术介绍
中现有技术存在的问题。本专利技术采用以下技术方案：一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)免疫原制备根据PPV6流行毒株(GenBank：KX384821.1、MH820262.1、MH447540.1和MK378402.1)基因组序列设计2条特异性引物(P1和P2)，对采集于辖区及周边区域的母猪流产胎儿样品进行PCR鉴定；以PCR扩增片段为目的序列，构建pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，并对阳性重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定；阳性克隆菌于37℃、1mmol/LIPTG诱导表达6h，表达菌液超声破碎，12000r/min离心收集上清裂解液，Ni-NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，SDS-PAGE分析，Westernblot鉴定；纯化后复性VP2蛋白与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。(2)高免血清制备以纯化后复性VP2蛋白为免疫原，背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，首次使用弗氏完全佐剂乳化的VP2蛋白免疫原，免疫剂量为200μg/只；首免后14d、28d和42d改用弗氏不完全佐剂乳化的VP2蛋白免疫原，进行加强免疫，免疫剂量均为400μg/只；第四次免疫后7d(即首免后49d)颈动脉放血，4000r/min离心分离血清，收集抗体效价≥1:25600的高免血清，备用。(3)抗体纯化、脱盐、浓缩饱和(NH4)2SO4盐析方法的步骤如下：S1、采用生理盐水稀释高免兔血清，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH4)2SO4溶液至终浓度为20％，静置30min，3000r/min离心20min，弃去沉淀；S2、向步骤S1得到的上清溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH4)2SO4溶液至终浓度45％，静置30min，3000r/min离心20min，弃去沉淀；S3、向步骤S2所得沉淀中加入生理盐水溶解，磁力搅拌下缓慢滴加预冷饱和(NH4)2SO4溶液至终浓度33％，静置30min，3000r/min离心20min，弃去上清，S4、重复步骤S3三次；S5、向步骤S2所得沉淀中加入PBS溶解，4000r/min超滤浓缩30min脱盐。S6、取3～4mL超滤透析液，滴加1～2滴纳氏试剂，检测超滤透析液中是否存在NH4+(出现砖红色即有NH4+存在)。(4)抗体鉴定、过滤除菌及分装。采用SDS-PAGE、Westernblot和IFA对纯化后抗体进行鉴定，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-40℃保存。其中所述PCR扩增片段大小为981bp。所述重组VP2蛋白大小为40kD，该蛋白与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙脑病毒阳性血清不发生交叉反应。所述免疫佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，检测抗体效价是指采用间接ELISA方法检测免疫兔血清的抗体效价。所述试验动物为20日龄、健康、体重相似的新西兰大耳白兔。本专利技术公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，由专利技术人根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni-NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)2SO4盐析方法纯化抗体。制备的兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪细小病毒6型VP2蛋白抗体外的其他猪常见病原抗体。以上特征充分满足了外源病毒检验用阳性血清的要求，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。附图说明图1是本专利技术实施例提供的PPV6VP2基因PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1，2：阴性ddH2O对照；3，4：PPV6VP2基因PCR扩增产物。图2是本专利技术实施例提供的pET30a-PPV6-VP2重组质粒PCR扩增的结果图，图中，M：DL200本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n(1)引物设计与合成/n(2)重组表达载体构建及鉴定/n(3)重组VP2蛋白诱导表达、纯化、鉴定及浓缩/n(4)高免血清制备/n(5)抗体纯化、脱盐、鉴定/n(6)抗体浓缩、过滤除菌及分装。/n

【技术特征摘要】
1.一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
(2)重组表达载体构建及鉴定
(3)重组VP2蛋白诱导表达、纯化、鉴定及浓缩
(4)高免血清制备
(5)抗体纯化、脱盐、鉴定
(6)抗体浓缩、过滤除菌及分装。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PCR扩增引物为1对，即P1、P2，扩增片段大小为981bp；
所述引物的基因序列如下：
P1：5'-CAGGATCCAGACCCCTTGGTGCTATT-3'，下划线为BamHI酶切位点；
P2：5'-GCCTCGAGCACTCCAGGGTTCCAGAT-3'，下划线为XhoI酶切位点。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：制备猪细小病毒6型VP2蛋白免疫原的过程为：
(a)构建pET30a-PPV6-VP2重组表达载体，PCR、双酶切和测序鉴定重组质粒；
(b)阳性克隆菌于37℃、1mmol/LIPTG诱导表达6h，表达菌液超声破碎，12000r/min离心收集上清裂解液，表达蛋白Ni-NTA树脂亲和层析纯化，SDS-PAGE分析，Westernblot鉴定，重组VP2蛋白大小为40kD；
(c)纯化后蛋白液依次在8M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素、PBS液中进行透析复性，每次透析时间为6h，5000r/min超滤浓缩；
(d)按照免疫剂量，将纯化后复性VP2蛋白与弗氏佐剂1:1混匀乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧云文，潘琴，张杰，王勤，刘俐君，代军飞，石义成，任绍科，邓书明，
申请(专利权)人：开江县动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：四川;51