一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH‑VLλ11及其制备方法。ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到总cDNA片段，以cDNA为模板，在相应的带有Linker接头的引物的作用下，通过SOE‑PCR的方法得到猪源ScFv抗体基因序列，将ScFv抗体基因序列构建至PET‑30a载体，转化BL21（DE3）感受态细胞，筛选得到一个针对于非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH‑VLλ11，对筛选得到的ScFv抗体VH‑VLλ11进行初步活性鉴定发现此抗体具有非洲猪瘟反应活性。本发明专利技术的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanswinefeverVirus,ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，具有高度接触性传染的特点。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是已知的唯一以媒介虫传播的病毒。非洲猪瘟在1921年首次爆发于非洲肯尼亚，于2018年8月传入我国，截至2019年2月，全国已有24个省份发生非洲猪瘟疫情，给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界范围内还没有针对此病毒的有效疫苗，因此非洲猪瘟的早期诊断对该病的防控起着至关重要的作用。抗体是体液免疫中的关键效应分子，也是疫苗和诊断试剂中的核心成分，抗体的研发对非洲猪瘟的防控起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难，此时，一种新型抗体的研发与制备可能成为了防控此病的突破口。中国专利技术专利(公布号CN110078819A)一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法，该抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。该专利得到的抗体为禽源非洲猪瘟抗体，存在异源性反应，且没有克服常规抗体分子量较大的问题。>单链抗体作为第三代抗体(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注。单链抗体是一种比常规抗体分子量小的抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，因此单链抗体具有很好的穿透性，易透过血管壁与靶细胞进行接触，适用于肿瘤的诊断和治疗；此外单链抗体因很好的保留了可变区域，因此对原抗原依然具有准确的特异性与亲和性；单链抗体作为一种人工合成的抗体，还易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用；单链抗体最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性反应，扩宽了抗体的应用范围。凭借以上特性单链抗体与普通抗体相比有很大优势。因此，单链抗体在疾病的治疗与诊断中具有很大的价值。回顾近些年来抗体领域的发展情况，传统的抗体已不能满足目前抗体市场的需求，人们急需一种制备简便、特异性强、稳定性高且分子量小的灵活抗体，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。综上所述，通过制备具有ASFV特异性、生物活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是单链抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的ASFV的临床诊断方法，控制ASF的疫情蔓延具有及其重要的意义。中国专利技术专利(公开号CN111040031A)和中国专利技术专利(公开号CN111560069A)均公开了一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，但这两种抗体的轻链均为κ轻链。现有技术尚未公开轻链为κ轻链以外的、抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体。
技术实现思路
本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒特异性的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11，所述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。SEQIDNO:1MEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSEYEFRGSLIHWVRQAPGKGLEWLATICTTDPITEYADSVKGRFTISRDSSQNTAYLQMDSLRGEDTARYYCGVAFSYGGGCHRMDLRGQGVEVVV；SEQIDNO:2：MSQTVIQEPAMSVSPGGTVTLTCAFSSGSESTRKYPIRFQQTPGQPPRLLIYHTNSRPTGVPSRFSGAISGNKAALTITGAQAEDEADYFCSLYIRTYNVPFGGGTHLTVL。本专利技术第二方面提供编码上述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段和编码上述ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段。优选的，编码ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段如SEQIDNO:3所示，编码ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段如SEQIDNO:4所示。SEQIDNO:3：5’-ATGGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGAATACGAATTCCGTGGATCCTTGATTCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTGCAACTATCTGTACTACTGATCCTATAACGGAATACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGGCGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGGAGTTGCCTTCAGCTATGGGGGGGGCTGTCATCGAATGGATCTCAGGGGCCAAGGCGTTGAAGTCGTCGTG-3’；SEQIDNO:4：5’-ATGTCTCAGACTGTGATCCAGGAGCCGGCGATGTCAGTGTCTCCTGGAGGGACCGTCACACTCACCTGTGCCTTTAGCTCAGGGTCAGAATCTACTAGGAAGTACCCCATTAGGTTCCAGCAGACACCAGGCCAGCCTCCCCGACTGCTGATCTACCACACCAATAGCCGCCCGACTGGGGTCCCCAGTCGCTTCTCTGGAGCCATCTCTGGGAACAAAGCCGCCCTCACTATCACGGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTATTTCTGTAGTCTCTATATAAGGACTTATAATGTTCCCTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTCG-3’。本专利技术第三方面提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含编码ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段和编码ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段。本专利技术第四方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述重组表达载体。本专利技术第五方面，提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的制备方法，包括以下步骤：(1)淋巴细胞分离：从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；(2)淋巴细胞总mRNA的提取：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11，其特征在于，所述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11，其特征在于，所述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.编码权利要求1中所述的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段。


3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，编码ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段如SEQIDNO:3所示，编码ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段如SEQIDNO:4所示。


4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2中的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段。


5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求4所述的重组表达载体。


6.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、权利要求2所述的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备非洲猪瘟病毒诊断试剂中的应用。


7.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、权利要求2所述的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备非洲猪瘟病毒治疗试剂中的应用。


8.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、权利要求2所述的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备抗原表位研究制品中的应用。


9.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
（2）淋巴细胞总mRNA的提取：
提取步骤（1）分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
（3）全基因cDNA合成：
以步骤（2）提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
（4）第一轮扩增：
以步骤（3）合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1；W1、Q1为引物进行第一轮扩增，扩增程序分别为：98°C2min，98°C10s、52°C5s、72°C30s、30个循环，72°C10min；98°C2min，98°C10s、53°C5s、72°C30s、30个循环，72°C10min，将扩增产物电泳，纯化收集目标产物，-20℃保存备用；
（5）第二轮扩增：
以第一轮...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，王丽娟，田宏，石正旺，罗俊聪，杨波，张克山，茹毅，李丹，杨帆，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62