一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组制造技术

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD‑RMA法检测人鼻病毒的引物探针组，包括检测人鼻病毒的引物对及对应的探针，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第33个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3‑spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。本发明专利技术的检测方法特异性强、灵敏度高，操作简便，检测时间短，能够快速且准确地鉴定人鼻病毒，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组
本申请属于生物检测
，具体为一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组。
技术介绍
人鼻病毒(Humanrhinovirus，HRV)属小RNA病毒科，是普通感冒的最主要病原体之一，大约有10％-20％的成年人感冒是由鼻病毒感染引起，而婴儿感冒有15％-30％是由鼻病毒导致。HRV感染具有自限性，但是有时会引起诸如哮喘、充血性心衰、支气管扩张，包囊纤维化等严重并发症，并且HRV多与其它呼吸道病毒合并感染，例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒以及肠道病毒等。目前HRV的检测方法有组织培养、血清抗体检测及实时荧光定量PCR等。其中，HRV分离是检测HRV感染的金标准，但由于其需要的细胞培养条件苛刻，而检出率较低，耗时较长，故不宜用于HRV的快速检测；由于人鼻病毒具有众多血清型，缺乏合适的交叉反应抗原，使得血清学方法检测人鼻病毒抗体受到很大限制；实时荧光定量PCR需要相关的昂贵仪器设备且需要有专业技术人员操作，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制。而重组酶介导扩增(RecombinaseMediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平；且RMA可以与侧流层析技术(LFD)结合，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅使用侧流层析试纸就可以通过肉眼观察结果。因此可实现HRV的快速检测。本专利技术采用LFD-RMA法建立快速检测人鼻病毒的方法，为人鼻病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组本申请是通过下述方案实现的：一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组，包括检测人鼻病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：HRV-F：5’-CAGGAGGGAAGGATGGTAGAGAATGGGACACAG-3’；HRV-R：5’-[Biotin]TGCCAAACACTTTGATATCACTCGCTCCGGTTC-3’；HRV-P：5’-[FAM]TCACGATAACTTTCACAGGGTTGGGATCGGCA[dSpacer]ATTACATGTTCTATG[C3-spacer]-3’。优选的，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第33个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括终浓度各10μM的RMA引物对及检测探针组、100ng/μL的大肠杆菌RecA蛋白、40ng/μL的UvsY蛋白、800ng/μL的单链结合蛋白GP32、60ng/μL的Bst聚合酶、200ng/μL的M-MLV逆转录酶、80ng/μL的核酸内切酶IV。所述醋酸镁的终浓度为100mM。所述缓冲液包括下述组分：50mM的Tris、10％w/v的聚环氧乙烷、2mM的海藻糖、2.5mM的甘露醇、10mM的ATP、2mM的dNTPs、1000ng/mL的肌酸激酶和25mM的磷酸肌酸。所述标准阳性质粒为含有HRV基因片段的重组质粒，用于HRV核酸检测的阳性对照。所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。所述试剂盒可以检测的样品为咽拭子或鼻咽拭子。一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒HRV的方法，包括以下步骤：(1)提取待测样本的RNA。(2)设计用于HRV检测的引物对及探针。(3)以提取的待测样本RNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min。(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有HRV；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有HRV。有益效果：本专利技术提供的基于LFD-RMA法快速检测人鼻病毒的试剂盒，不需要大型仪器设备，操作方便，检测时间短，只需在30-42℃下30min内即可完成检测；且将重组酶介导扩增和侧流层析技术相结合，既可以实现人鼻病毒核酸的等温体外快速扩增，又可以实现检测结果的可视化，为人鼻病毒的临床快速诊断提供了一种新的手段。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1LFD-RMA法检测HRV的灵敏性试验；图2LFD-RMA法检测HRV的特异性试验。图中序号代表：1：1×105copies/μL；2：1×104copies/μL；3：1×103copies/μL；4：1×102copies/μL；5：1×101copies/μL。具体实施方式为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。实施例11、阳性标准质粒的制备提取HRV的核酸作为模板，对HRV的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。2、RMA引物与探针的设计根据HRV的VP1基因设计了特异性RMA引物与探针，具体如表1所示：表1引物与探针序列3、RMA反应体系的建立将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本核酸加入到含有扩增反应试剂的检测管中，混匀，最后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照。其中，所述恒温扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括终浓度各10μM的RMA引物对及检测探针组、100ng/μL的大肠杆菌RecA蛋白、40ng/μL的UvsY本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测人鼻病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：/nHRV-F：/n5’-CAGGAGGGAAGGATGGTAGAGAATGGGACACAG-3’；/nHRV-R：/n5’-[Biotin]TGCCAAACACTTTGATATCACTCGCTCCGGTTC-3’；/nHRV-P：/n5’-[FAM]TCACGATAACTTTCACAGGGTTGGGATCGGCA[dSpacer]ATTACATGTTCTATG[C3-spacer]-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测人鼻病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
HRV-F：
5’-CAGGAGGGAAGGATGGTAGAGAATGGGACACAG-3’；
HRV-R：
5’-[Biotin]TGCCAAACACTTTGATATCACTCGCTCCGGTTC-3’；
HRV-P：
5’-[FAM]TCACGATAACTTTCACAGGGTTGGGATCGGCA[dSpacer]ATTACATGTTCTATG[C3-spacer]-3’。


2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人鼻病毒的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第33个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。


3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，陈龙，张瑶，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37